Krasnoyarsk, Krasnoyarsk, Russian Federation
UDC 615.015.8
Currently, there is little information on the levels and changes in pathogenic bacteria of cattle feces and their antibiotic resistance on dairy farms. Monitoring of antibiotic resistance of bacteria isolated from livestock farm waste is necessary. The purpose of the study is to investigate the composition of fecal microflora and analyze its antibiotic resistance. Using routine bacteriological methods, as well as mass spectrometry, the species composition of fecal microflora of cattle was determined, and the disk diffusion method was used to analyze its antibiotic resistance. In the course of the work, data were obtained on the quantitative and qualitative composition of the intestinal microbiome of cattle and the specificity of antibiotic resistance to such drugs as ampicillin in two dosages (2 μg and 10 μg), amoxicillin + clavulanic acid 20/10 μg, benzylpenicillin 1 ME, tetracycline 30 μg, erythromycin 15 μg was revealed. These groups of antibiotics are most often used in animal husbandry. The study will help to determine the antibiotics to which the bacteria of the intestinal microflora of cattle are resistant, since, due to their excessive use, resistance to them appears not only in pathogenic bacteria, but also in the so-called opportunistic microorganisms, of which there are many more, and normally they are not dangerous, but with weakened immunity they can cause various diseases. High resistance of intestinal microflora bacteria to the most popular drugs used in animal husbandry, in particular on dairy farms for the treatment of cattle, has been revealed. Antimicrobial drugs are a tool used on livestock farms to ensure animal health, and this tool should be used rationally.
intestinal microbiome, antibiotics, manure, antibiotic resistance, cattle
Введение. Отрасль животноводства является одним из крупнейших потребителей антимикробных препаратов. Животноводческие предприятия в большинстве случаев с лечебной и профилактической целью применяют значительные количества лекарственных препаратов [1, 2, 3]. Вследствие чего многие штаммы, имеющие антибиотикорезистентность происходят из животноводческих комплексов. Также вследствие избыточного использования антибиотиков, устойчивость к ним появилась не только у болезнетворных бактерий, но и у так называемых условно патогенных микроорганизмов, которых гораздо больше, и в норме они не опасны для человека, но при ослаблении иммунитета способны вызывать различные заболевания [4, 5].
Болезнетворные микроорганизмы и остатки антибиотиков являются основными вредными композициями в навозе (фекалиях, накопленных в естественных условиях) [6]. Согласно статистике ВОЗ, ежегодно в мире насчитывается около 1,5 миллиарда пациентов с диареей, и 70% этих случаев были вызваны пищей, зараженной микроорганизмами [7, 8]. Патогенные микроорганизмы могут выживать в воде, почве и других областях окружающей среды в течение длительного времени, а затем влиять на здоровье человека через сельскохозяйственные культуры или продукты животного происхождения [4, 9]. В настоящее время в фекалиях идентифицировано более 150 патогенов.
Опасности накопленного коровьего навоза уделяется меньше внимания, при этом он широко используется для выращивания сельскохозяйственных культур или овощей [10, 11]. На сегодняшний момент имеется мало информации об уровнях и изменениях патогенных бактерий, входящих в состав фекалий крупного рогатого скота и их антибиотикорезистентности, на молочных фермах. [5, 7]. Таким образом необходим мониторинг антибиотикорезистентности бактерий, выделяемых из отходов животноводческих ферм.
Цель работы - изучение состава фекальной микрофлоры и анализ ее антибиотикорезистентности.
Условия, материалы и методы. Для бактериологического исследования отбирали пробы свежих фекалий крупного рогатого скота (КРС) животноводческой фермы ООО ОПХ «Солянское», Рыбинского района Красноярского края, в 7 точках: дойная база, септик-1, база КРС, септик-2, база КРС, септик-3, база №17, база №15, д. Рябинки база «решетка» и база 9. Отбирали 1,0 г навоза в трёх повторностях и далее делали смешанную пробу.
Для подсчета количества колоний и выделения чистой культуры предварительно разводили образцы в стерильно физиологическом растворе 0.8% в пробирках до 10-кратного и полученные последовательные 10-кратные разведения засевали на чашки Петри с различными селективными, обогащенными и дифференциально-диагностическими средами (агар Сабуро – для выявления грибов, среда обогащения магниевая, агар Плоскирева, агар Левина, желточно-солевой агар, агар Эндо, кровяной агар, агар для лактобактерий, агар для бифидобактерий, среда Вильсон-Блер – для обнаружения клостридий, лактозный ТТХ агар с тергитолом 7 – для выделения энтерококков). Питательные среды подбирали для выделения кишечной микрофлоры, подбор питательных сред проводился для выделения аэробных и анаэробных микроорганизмов (более 20 видов патогенной, условно-патогенной и сапрофитной микрофлоры). Количественное содержание микроорганизмов в 1,0 г биоматериала определяли путем подсчета выросших на чашках Петри колоний (для каждого разведения отдельно). Далее все серийные разведения помещали в термостат при температуре 37ºС на 18–24 часов. Далее оценено наличие и осуществлен подсчет микроорганизмов и высев колоний на среду Олькеницкого, магниевую среду, висмут-сульфидный агар и агар Левина, посевы инкубировали при 37ºС в течении 18–24 часов. Далее оценивали рост на дифференциально-диагностических средах и проводили окраску по Граму и микроскопирование для выделения чистой и изолированной культуры, с последующей идентификацией до вида. Для видовой идентификации бактерий и грибов в навозе был применен метод масс-спектрометрии.
Далее определяли антибиотикорезистентность микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом. Антибактериальные препараты наносились диспенсером на чашки Петри с Мюллер-Хинтон агаром. Агар предварительно подсушили при комнатной температуре с нанесенным на него инокулюмом исследуемой культуры 0,5 по стандарту МакФарланда. Далее инкубировали при 37ºС в течении 18-24 часов, по истечении времени оценивали зону задержки роста антибактериального препарата и исследуемого микроорганизма на аппарате ADAGIO, который автоматически считывает зоны задержки роста. Для определения антибиотикорезистентности микроорганизмов, выделенных из отходов молочной фермы, были использованы диски с такими антимикробными препаратами, как ампициллин в двух дозировках (2 мкг и 10 мкг), амоксициллин + клавулановая кислота 20\10 мкг, бензилпенициллин 1 МЕ, тетрациклин 30 мкг, эритромицин 15 мкг.
Результаты и обсуждение. В результате микробиологического анализа смешанных частей свежих фекалий, полученных с разных септиков, было установлено, что наибольшее количество представителей кишечной микрофлоры относятся к сапрофитным бактериям, бифидобактерии и лактобактерии, количество которых превышало 108 – 1010 на 1 мл образца (табл. 1 и 2).
Таблица 1 – Количественный и качественный состав кишечной микрофлоры крупного рогатого скота, уровень антибиотикорезистентности к полусинтетическим пенициллинам
|
Виды микроорганизмов |
КОЕ/мл |
Бензил-пенициллин (˂18 – R) |
Ампицил-лин 2 мкг (˂14 – R) |
Ампициллин 10 мкг (˂14 – R) |
Амоксициллин + клавулановая кислота (˂19 – R) |
|
Proteus mirabillis |
103 |
0 (R) |
0 (R) |
0 (R) |
16 (R) |
|
Klebsiella pneumoniae |
103 |
- |
- |
- |
- |
|
Escherichia coli |
106 |
0 (R) |
14 (R) |
20 (S) |
23 (S) |
|
Acinetobacter calcoaceticus |
105 |
- |
- |
- |
- |
|
Acinetobacter lwoffii |
105 |
0 (R) |
12 (R) |
19 (S) |
22 (S) |
|
Pseudomonas aeruginosa |
106 |
0 (R) |
0 (R) |
0 (R) |
0 (R) |
|
Bacillus subtilis |
106 |
13 (R) |
19(R) |
25 (S) |
32 (S) |
|
α-streptococcus |
108 |
- |
- |
- |
- |
|
Enterococcus faecalis |
105 |
24 (S) |
25 (S) |
25 (S) |
30 (S) |
|
Staphylococcus epidermidis |
102 |
- |
- |
- |
- |
|
Staphylococcus saprophyticus |
103 |
0 (R) |
0 (R) |
0 (R) |
|
|
Staphylococcus aureus |
103 |
- |
- |
- |
|
|
Bifidobacterium spp. |
1010 |
- |
- |
- |
|
|
Lactobacillus spp. |
108 |
- |
- |
- |
|
|
Clostridium spp. |
105 |
- |
- |
- |
|
|
Penicillum spp. |
104 |
- |
- |
- |
|
|
Candida spp. |
103 |
- |
- |
- |
|
|
Carcina spp |
105 |
- |
- |
- |
|
Таблица 2 – Количественный и качественный состав кишечной микрофлоры крупного рогатого скота, уровень антибиотикорезистентности к макролидам и тетрациклинам
|
Виды микроорганизмов |
КОЕ/мл |
Эритромицин (˂24 – R) |
Тетрациклин (˂22 – R) |
|
Proteus mirabillis |
103 |
0 (R) |
0 (R) |
|
Klebsiella pneumoniae |
103 |
- |
- |
|
Escherichia coli |
106 |
0 (R) |
18 (R) |
|
Acinetobacter calcoaceticus |
105 |
- |
- |
|
Acinetobacter lwoffii |
105 |
17 (R) |
23 (S) |
|
Pseudomonas aeruginosa |
106 |
0 (R) |
0 (R) |
|
Bacillus subtilis |
106 |
0 (R) |
12 (R) |
|
α-streptococcus |
108 |
- |
- |
|
Enterococcus faecalis |
105 |
20 (R) |
25 (S) |
|
Staphylococcus epidermidis |
102 |
- |
- |
|
Staphylococcus saprophyticus |
103 |
0 (R) |
0 (R) |
|
Staphylococcus aureus |
103 |
- |
- |
|
Bifidobacterium spp. |
1010 |
- |
- |
|
Lactobacillus spp. |
108 |
- |
- |
|
Clostridium spp. |
105 |
- |
- |
|
Penicillum spp. |
104 |
- |
- |
|
Candida spp. |
103 |
- |
- |
|
Carcina spp |
105 |
- |
- |
Также было выявлено высокое значение α-гемолитических (зеленящих) стрептококков, из которых чаще всего выявлялись S. dysgalactiae и S. equi, которые являются зоонозами и вызывают инфекционные заболевания у коров. Такие микроорганизмы, как гемолитические E. coli, P. aeruginosa и B. subtilis выявлялись в концентрации 106 KOE/мл, немногим меньше, в количестве 105 KOE/мл представлены бактерии E. faecalis, A. calcoaceticus и А. lwoffii, а также клостридии и сарцины.
Данные бактерии относятся к условно-патогенным и способны при попадании в молочную продукцию вызывать различного рода инфекционные заболевания у человека. Исследование кишечной микрофлоры показало низкое количество, в диапазоне 102–103 KOE/мл, таких микроорганизмов как P. mirabillis, K. pneumoniae, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. aureus, а также грибов родов Candida и Penicillum.
Несмотря на то, что молочные коровы используют антибиотики реже, чем другие мясные животные, в коровьем навозе также обнаруживаются лекарственные препараты и бактерии, резистентные к широкому спектру антибиотиков. Распространение таких бактерий может ограничивать терапевтический потенциал антибиотиков, тем самым создавая потенциальную угрозу для здоровья людей и скота [7]. Таким образом особый интерес представляет изучение антибиотикорезистентности бактерий, выделенных из кишечной микрофлоры КРС. Противомикробные препараты уже несколько десятилетий широко используются в традиционном животноводстве. Показано, что беспорядочное применение антибиотиков в животноводстве создаёт благоприятные условия для быстрой эволюции патогенности и вирулентности микроорганизмов и формирования у них антибиотикорезистентности. Наличие в комбикормах даже остаточных количеств антибиотиков может вызвать различные нарушения здоровья людей [3, 9]. Анализ антибиотикорезистентности бактерий кишечной микрофлоры показал, что штаммы P. mirabillis и P. aeruginosa были резистентны ко всем исследуемым классам антибиотиков (макролиды, пенициллины, в том числе и комбинированного состава (амоксициллин + клавулановая кислота) и тетрациклины). Штаммы бактерии S. saprophyticus были чувствительны только к комбинированному антибактериальному препарату – амоксициллин + клавулановая кислота 20\10 мкг. Это комбинированное антибактериальное средство, сочетание бактерицидного антибиотика широкого спектра действия из группы полусинтетических пенициллинов — амоксициллина и ингибитора бета-лактамаз — клавулановой кислоты. E. coli и B. subtilis чувствительны к таким препаратам как амоксициллин + клавулановая кислота и ампициллин в дозировке 10 мкг (относящийся к группе полусинтетических пенициллинов), но проявляли устойчивость к таким антибиотикам, как эритромицин (группа макролидов) и тетрациклин (группа тетрациклинов), а также к некоторым препаратам, относящимся к полусинтетическим пенициллинам. Штаммы бактерий вида A. lwoffii проявляли устойчивость в отношении эритромицина, бензилпенициллина и ампициллина в дозировке 2 мкг, но были чувствительны к ампициллину в дозировке 10 мкг, комбинированному препарату и тетрациклину. Наибольшую чувствительность проявляли штаммы бактерии E. faecalis, которые были резистентны только к эритромицину и чувствительны к антибиотикам группы полусинтетических пенициллинов и тетрациклинов, несмотря на то что одной из отличительных особенностей этого класса бактерий является изначальная природная устойчивость к целому ряду антибактериальных препаратов.
В результате анализа антибиотикорезистентности фекальной микрофлоры показано, что к эритромицину были устойчивы все выделенные штаммы, относящиеся к условно-патогенным бактериям. При этом к данному препарату природную устойчивость проявляют только грамотрицательные палочки: Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa. К бензилпенициллину, ампициллину в дозировке 2 мкг и тетрациклину были устойчивы большинство выделенных штаммов бактерий. Наибольшее количество изученных микроорганизмов были чувствительны к ампициллину в дозировке 10 мкг и комбинированному препарату амоксициллин + клавулановая кислота.
Выводы. Таким образом выявлена высокая резистентность бактерий кишечной микрофлоры к наиболее популярным препаратам, которые используются в животноводстве, в частности на молочных фермах для лечения КРС. Изученные микроорганизмы вырабатывают устойчивость к препаратам в связи с нерациональным использованием антибиотиков. Антимикробные препараты — это инструмент, используемый на животноводческих фермах для обеспечения здоровья животных, и этот инструмент должен использоваться рационально.
1. Beukers AG, Zaheer R, Goji N. Comparative genomics of Enterococcus spp. isolated from bovine feces. BMC Microbiol. 2017; 17(1). 52 p. http:// doi.org/10.1186/s12866-017-0962-1 EDN: https://elibrary.ru/YYOQKL
2. Kyselkova M, Jirout J, Vrchotova N. Spread of tetracycline resistance genes at a conventional dairy farm. Front Microbiol. 2015; 6. 536 p. http:// doi.org/10.3389/fmicb.2015.00536
3. Zhu Z, Cao M, Wang W. Exploring the prevalence and distribution patterns of antibiotic resistance genes in bovine gut microbiota using a metagenomic approach. Microb Drug Resist. 2021; 7. 980-990 p. https://doi.org/10.1089/mdr.2020.0271 EDN: https://elibrary.ru/UHKTTO
4. Cheng G, Hao H, Xie S. Antibiotic alternatives: the substitution of antibiotics in animal husbandry? Front Microbiol. 2014; 5. 217 p. https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00217 EDN: https://elibrary.ru/USSJDV
5. Collis RM, Biggs PJ, Burgess SA. Impact of systemic antimicrobial therapy on the faecal microbiome in symptomatic dairy cows. PLoS One. 2024; 19(1). e0296290. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0296290 EDN: https://elibrary.ru/NDIAAJ
6. Almasaudi SB, Saudi J. Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens: epidemiology and resistance features. Biol Sci. 2018; Vol.25. 586-596 p. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2016.02.009
7. Brooks AW, Kohl KD, Brucker RM. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history. Plos Biol. 2017; 15. e1002587. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002587
8. Grassmann F. Conduct and quality control of differential gene expression analysis using high-throughput transcriptome sequencing (RNASeq). Methods Mol Biol. 2019; 1834. 29-43 p. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8669-9_2
9. Doane MP, Haggerty JM, Kacev D. The skin microbiome of the Common thresher shark (Alopias vulpinus) has low taxonomic and potential metabolic b-diversity. Environ Microbiol Rep. 2017; 9. 357-373 p. https://doi.org/10.1111/1758-2229.12537 EDN: https://elibrary.ru/YHIDAM
10. Delahoy MJ, Wodnik B, Mcaliley L. Pathogens transmitted in animal feces in low- and middle-income countries. Int J Hygiene Environ Health. 2018; 221. 661-676 p. https://doi.org/10.1016/j.ijheh.2018.03.005
11. Ferri M, Ranucci E, Romagnoli P. Antimicrobial resistance: a global emerging threat to public health systems. Crit Rev Food Sci Nutrit. 2017; 57. 2857-2876 p. https://doi.org/10.1080/10408398.2015.1077192
