Красноярск, Красноярский край, Россия
УДК 615.015.8 Резистентность микрорганизма
На сегодняшний момент имеется мало информации об уровнях и изменениях патогенных бактерий, входящих в состав фекалий крупного рогатого скота и их антибиотикорезистентности, на молочных фермах. Необходим мониторинг антибиотикорезистентности бактерий, выделяемых из отходов животноводческих ферм. Цель исследования: изучение состава фекальной микрофлоры и анализ ее антибиотикорезистентности. С помощью рутинных бактериологических методов, а также масс-спектрометрии проводилось определение видового состава фекальной микрофлоры крупного рогатого скота (КРС), а диско-диффузионным методом – анализ ее антибиотикорезистентности. В ходе работы получены данные о количественном и качественном составе кишечного микробиома крупного рогатого скота и выявлена специфика антибиотикорезистентности к таким препаратам как ампициллин в двух дозировках (2 мкг и 10 мкг), амоксициллин + клавулановая кислота 20\10 мкг, бензилпенициллин 1 МЕ, тетрациклин 30 мкг, эритромицин 15 мкг. Эти группы антибиотиков наиболее часто используются в животноводстве. Исследование поможет определить антибиотики, к которым резистентны бактерии кишечной микрофлоры КРС, поскольку, вследствие их избыточного использования, устойчивость к ним появляется не только у болезнетворных бактерий, но и у так называемых условно патогенных микроорганизмов, которых гораздо больше, и в норме они не опасны, но при ослаблении иммунитета способны вызывать различные заболевания. Выявлена высокая резистентность бактерий кишечной микрофлоры к наиболее популярным препаратам, которые используются в животноводстве, в частности на молочных фермах для лечения скота. Антимикробные препараты — это инструмент, используемый на животноводческих фермах для обеспечения здоровья животных, и этот инструмент должен использоваться рационально.
кишечный микробиом, антибиотики, навоз, антибиотикорезистентность, крупный рогатый скот
Введение. Отрасль животноводства является одним из крупнейших потребителей антимикробных препаратов. Животноводческие предприятия в большинстве случаев с лечебной и профилактической целью применяют значительные количества лекарственных препаратов [1, 2, 3]. Вследствие чего многие штаммы, имеющие антибиотикорезистентность происходят из животноводческих комплексов. Также вследствие избыточного использования антибиотиков, устойчивость к ним появилась не только у болезнетворных бактерий, но и у так называемых условно патогенных микроорганизмов, которых гораздо больше, и в норме они не опасны для человека, но при ослаблении иммунитета способны вызывать различные заболевания [4, 5].
Болезнетворные микроорганизмы и остатки антибиотиков являются основными вредными композициями в навозе (фекалиях, накопленных в естественных условиях) [6]. Согласно статистике ВОЗ, ежегодно в мире насчитывается около 1,5 миллиарда пациентов с диареей, и 70% этих случаев были вызваны пищей, зараженной микроорганизмами [7, 8]. Патогенные микроорганизмы могут выживать в воде, почве и других областях окружающей среды в течение длительного времени, а затем влиять на здоровье человека через сельскохозяйственные культуры или продукты животного происхождения [4, 9]. В настоящее время в фекалиях идентифицировано более 150 патогенов.
Опасности накопленного коровьего навоза уделяется меньше внимания, при этом он широко используется для выращивания сельскохозяйственных культур или овощей [10, 11]. На сегодняшний момент имеется мало информации об уровнях и изменениях патогенных бактерий, входящих в состав фекалий крупного рогатого скота и их антибиотикорезистентности, на молочных фермах. [5, 7]. Таким образом необходим мониторинг антибиотикорезистентности бактерий, выделяемых из отходов животноводческих ферм.
Цель работы - изучение состава фекальной микрофлоры и анализ ее антибиотикорезистентности.
Условия, материалы и методы. Для бактериологического исследования отбирали пробы свежих фекалий крупного рогатого скота (КРС) животноводческой фермы ООО ОПХ «Солянское», Рыбинского района Красноярского края, в 7 точках: дойная база, септик-1, база КРС, септик-2, база КРС, септик-3, база №17, база №15, д. Рябинки база «решетка» и база 9. Отбирали 1,0 г навоза в трёх повторностях и далее делали смешанную пробу.
Для подсчета количества колоний и выделения чистой культуры предварительно разводили образцы в стерильно физиологическом растворе 0.8% в пробирках до 10-кратного и полученные последовательные 10-кратные разведения засевали на чашки Петри с различными селективными, обогащенными и дифференциально-диагностическими средами (агар Сабуро – для выявления грибов, среда обогащения магниевая, агар Плоскирева, агар Левина, желточно-солевой агар, агар Эндо, кровяной агар, агар для лактобактерий, агар для бифидобактерий, среда Вильсон-Блер – для обнаружения клостридий, лактозный ТТХ агар с тергитолом 7 – для выделения энтерококков). Питательные среды подбирали для выделения кишечной микрофлоры, подбор питательных сред проводился для выделения аэробных и анаэробных микроорганизмов (более 20 видов патогенной, условно-патогенной и сапрофитной микрофлоры). Количественное содержание микроорганизмов в 1,0 г биоматериала определяли путем подсчета выросших на чашках Петри колоний (для каждого разведения отдельно). Далее все серийные разведения помещали в термостат при температуре 37ºС на 18–24 часов. Далее оценено наличие и осуществлен подсчет микроорганизмов и высев колоний на среду Олькеницкого, магниевую среду, висмут-сульфидный агар и агар Левина, посевы инкубировали при 37ºС в течении 18–24 часов. Далее оценивали рост на дифференциально-диагностических средах и проводили окраску по Граму и микроскопирование для выделения чистой и изолированной культуры, с последующей идентификацией до вида. Для видовой идентификации бактерий и грибов в навозе был применен метод масс-спектрометрии.
Далее определяли антибиотикорезистентность микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом. Антибактериальные препараты наносились диспенсером на чашки Петри с Мюллер-Хинтон агаром. Агар предварительно подсушили при комнатной температуре с нанесенным на него инокулюмом исследуемой культуры 0,5 по стандарту МакФарланда. Далее инкубировали при 37ºС в течении 18-24 часов, по истечении времени оценивали зону задержки роста антибактериального препарата и исследуемого микроорганизма на аппарате ADAGIO, который автоматически считывает зоны задержки роста. Для определения антибиотикорезистентности микроорганизмов, выделенных из отходов молочной фермы, были использованы диски с такими антимикробными препаратами, как ампициллин в двух дозировках (2 мкг и 10 мкг), амоксициллин + клавулановая кислота 20\10 мкг, бензилпенициллин 1 МЕ, тетрациклин 30 мкг, эритромицин 15 мкг.
Результаты и обсуждение. В результате микробиологического анализа смешанных частей свежих фекалий, полученных с разных септиков, было установлено, что наибольшее количество представителей кишечной микрофлоры относятся к сапрофитным бактериям, бифидобактерии и лактобактерии, количество которых превышало 108 – 1010 на 1 мл образца (табл. 1 и 2).
Таблица 1 – Количественный и качественный состав кишечной микрофлоры крупного рогатого скота, уровень антибиотикорезистентности к полусинтетическим пенициллинам
|
Виды микроорганизмов |
КОЕ/мл |
Бензил-пенициллин (˂18 – R) |
Ампицил-лин 2 мкг (˂14 – R) |
Ампициллин 10 мкг (˂14 – R) |
Амоксициллин + клавулановая кислота (˂19 – R) |
|
Proteus mirabillis |
103 |
0 (R) |
0 (R) |
0 (R) |
16 (R) |
|
Klebsiella pneumoniae |
103 |
- |
- |
- |
- |
|
Escherichia coli |
106 |
0 (R) |
14 (R) |
20 (S) |
23 (S) |
|
Acinetobacter calcoaceticus |
105 |
- |
- |
- |
- |
|
Acinetobacter lwoffii |
105 |
0 (R) |
12 (R) |
19 (S) |
22 (S) |
|
Pseudomonas aeruginosa |
106 |
0 (R) |
0 (R) |
0 (R) |
0 (R) |
|
Bacillus subtilis |
106 |
13 (R) |
19(R) |
25 (S) |
32 (S) |
|
α-streptococcus |
108 |
- |
- |
- |
- |
|
Enterococcus faecalis |
105 |
24 (S) |
25 (S) |
25 (S) |
30 (S) |
|
Staphylococcus epidermidis |
102 |
- |
- |
- |
- |
|
Staphylococcus saprophyticus |
103 |
0 (R) |
0 (R) |
0 (R) |
|
|
Staphylococcus aureus |
103 |
- |
- |
- |
|
|
Bifidobacterium spp. |
1010 |
- |
- |
- |
|
|
Lactobacillus spp. |
108 |
- |
- |
- |
|
|
Clostridium spp. |
105 |
- |
- |
- |
|
|
Penicillum spp. |
104 |
- |
- |
- |
|
|
Candida spp. |
103 |
- |
- |
- |
|
|
Carcina spp |
105 |
- |
- |
- |
|
Таблица 2 – Количественный и качественный состав кишечной микрофлоры крупного рогатого скота, уровень антибиотикорезистентности к макролидам и тетрациклинам
|
Виды микроорганизмов |
КОЕ/мл |
Эритромицин (˂24 – R) |
Тетрациклин (˂22 – R) |
|
Proteus mirabillis |
103 |
0 (R) |
0 (R) |
|
Klebsiella pneumoniae |
103 |
- |
- |
|
Escherichia coli |
106 |
0 (R) |
18 (R) |
|
Acinetobacter calcoaceticus |
105 |
- |
- |
|
Acinetobacter lwoffii |
105 |
17 (R) |
23 (S) |
|
Pseudomonas aeruginosa |
106 |
0 (R) |
0 (R) |
|
Bacillus subtilis |
106 |
0 (R) |
12 (R) |
|
α-streptococcus |
108 |
- |
- |
|
Enterococcus faecalis |
105 |
20 (R) |
25 (S) |
|
Staphylococcus epidermidis |
102 |
- |
- |
|
Staphylococcus saprophyticus |
103 |
0 (R) |
0 (R) |
|
Staphylococcus aureus |
103 |
- |
- |
|
Bifidobacterium spp. |
1010 |
- |
- |
|
Lactobacillus spp. |
108 |
- |
- |
|
Clostridium spp. |
105 |
- |
- |
|
Penicillum spp. |
104 |
- |
- |
|
Candida spp. |
103 |
- |
- |
|
Carcina spp |
105 |
- |
- |
Также было выявлено высокое значение α-гемолитических (зеленящих) стрептококков, из которых чаще всего выявлялись S. dysgalactiae и S. equi, которые являются зоонозами и вызывают инфекционные заболевания у коров. Такие микроорганизмы, как гемолитические E. coli, P. aeruginosa и B. subtilis выявлялись в концентрации 106 KOE/мл, немногим меньше, в количестве 105 KOE/мл представлены бактерии E. faecalis, A. calcoaceticus и А. lwoffii, а также клостридии и сарцины.
Данные бактерии относятся к условно-патогенным и способны при попадании в молочную продукцию вызывать различного рода инфекционные заболевания у человека. Исследование кишечной микрофлоры показало низкое количество, в диапазоне 102–103 KOE/мл, таких микроорганизмов как P. mirabillis, K. pneumoniae, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. aureus, а также грибов родов Candida и Penicillum.
Несмотря на то, что молочные коровы используют антибиотики реже, чем другие мясные животные, в коровьем навозе также обнаруживаются лекарственные препараты и бактерии, резистентные к широкому спектру антибиотиков. Распространение таких бактерий может ограничивать терапевтический потенциал антибиотиков, тем самым создавая потенциальную угрозу для здоровья людей и скота [7]. Таким образом особый интерес представляет изучение антибиотикорезистентности бактерий, выделенных из кишечной микрофлоры КРС. Противомикробные препараты уже несколько десятилетий широко используются в традиционном животноводстве. Показано, что беспорядочное применение антибиотиков в животноводстве создаёт благоприятные условия для быстрой эволюции патогенности и вирулентности микроорганизмов и формирования у них антибиотикорезистентности. Наличие в комбикормах даже остаточных количеств антибиотиков может вызвать различные нарушения здоровья людей [3, 9]. Анализ антибиотикорезистентности бактерий кишечной микрофлоры показал, что штаммы P. mirabillis и P. aeruginosa были резистентны ко всем исследуемым классам антибиотиков (макролиды, пенициллины, в том числе и комбинированного состава (амоксициллин + клавулановая кислота) и тетрациклины). Штаммы бактерии S. saprophyticus были чувствительны только к комбинированному антибактериальному препарату – амоксициллин + клавулановая кислота 20\10 мкг. Это комбинированное антибактериальное средство, сочетание бактерицидного антибиотика широкого спектра действия из группы полусинтетических пенициллинов — амоксициллина и ингибитора бета-лактамаз — клавулановой кислоты. E. coli и B. subtilis чувствительны к таким препаратам как амоксициллин + клавулановая кислота и ампициллин в дозировке 10 мкг (относящийся к группе полусинтетических пенициллинов), но проявляли устойчивость к таким антибиотикам, как эритромицин (группа макролидов) и тетрациклин (группа тетрациклинов), а также к некоторым препаратам, относящимся к полусинтетическим пенициллинам. Штаммы бактерий вида A. lwoffii проявляли устойчивость в отношении эритромицина, бензилпенициллина и ампициллина в дозировке 2 мкг, но были чувствительны к ампициллину в дозировке 10 мкг, комбинированному препарату и тетрациклину. Наибольшую чувствительность проявляли штаммы бактерии E. faecalis, которые были резистентны только к эритромицину и чувствительны к антибиотикам группы полусинтетических пенициллинов и тетрациклинов, несмотря на то что одной из отличительных особенностей этого класса бактерий является изначальная природная устойчивость к целому ряду антибактериальных препаратов.
В результате анализа антибиотикорезистентности фекальной микрофлоры показано, что к эритромицину были устойчивы все выделенные штаммы, относящиеся к условно-патогенным бактериям. При этом к данному препарату природную устойчивость проявляют только грамотрицательные палочки: Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa. К бензилпенициллину, ампициллину в дозировке 2 мкг и тетрациклину были устойчивы большинство выделенных штаммов бактерий. Наибольшее количество изученных микроорганизмов были чувствительны к ампициллину в дозировке 10 мкг и комбинированному препарату амоксициллин + клавулановая кислота.
Выводы. Таким образом выявлена высокая резистентность бактерий кишечной микрофлоры к наиболее популярным препаратам, которые используются в животноводстве, в частности на молочных фермах для лечения КРС. Изученные микроорганизмы вырабатывают устойчивость к препаратам в связи с нерациональным использованием антибиотиков. Антимикробные препараты — это инструмент, используемый на животноводческих фермах для обеспечения здоровья животных, и этот инструмент должен использоваться рационально.
1. Comparative genomics of Enterococcus spp. isolated from bovine feces / A.G. Beukers, R. Zaheer, N. Goji [et al.] // BMC Microbiol. 2017. 17(1). P. 52. http:// doi.org/10.1186/s12866-017-0962-1 EDN: https://elibrary.ru/YYOQKL
2. Spread of tetracycline resistance genes at a conventional dairy farm / M. Kyselkova, J. Jirout, N. Vrchotova [et al.] // Front Microbiol. 2015. 6. P. 536. http:// doi.org/10.3389/fmicb.2015.00536
3. Exploring the Prevalence and Distribution Patterns of Antibiotic Resistance Genes in Bovine Gut Microbiota Using a Metagenomic Approach / Z. Zhu, M. Cao, W. Wang [et al.] // Microb Drug Resist. 2021. 7. P. 980-990. https://doi.org/10.1089/mdr.2020.0271 EDN: https://elibrary.ru/UHKTTO
4. Antibiotic alternatives: the substitution of antibiotics in animal husbandry? / G. Cheng, H. Hao, S. Xie [et al.] // Front Microbiol. 2014. 5. P. 217. https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00217 EDN: https://elibrary.ru/USSJDV
5. Impact of systemic antimicrobial therapy on the faecal microbiome in symptomatic dairy cows / R. M. Collis, P. J. Biggs, S. A. Burgess [et al.] // PLoS One. 2024. 19(1). e0296290. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0296290 EDN: https://elibrary.ru/NDIAAJ
6. Almasaudi S. B., Saudi J. Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens: epidemiology and resistance features // Biol Sci. 2018. Vol. 25. P. 586–596. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2016.02.009
7. Brooks A. W., Kohl K. D., Brucker R. M. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history // Plos Biol. 2017. 15. e1002587. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002587
8. Grassmann F. Conduct and quality control of differential gene expression analysis using high-throughput transcriptome sequencing (RNASeq) // Methods Mol Biol., 2019. 1834. P. 29–43. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8669-9_2
9. The skin microbiome of the Common thresher shark (Alopias vulpinus) has low taxonomic and potential metabolic b-diversity / M. P. Doane, J. M. Haggerty, D. Kacev [et al.] // Environ Microbiol Rep. 2017. 9. P. 357–373. https://doi.org/10.1111/1758-2229.12537 EDN: https://elibrary.ru/YHIDAM
10. Pathogens transmitted in animal feces in low- and middle-income countries / M. J. Delahoy, B. Wodnik, L. Mcaliley [et al.] // Int J Hygiene Environ Health. 2018. 221. P. 661–676. https://doi.org/10.1016/j.ijheh.2018.03.005
11. Antimicrobial resistance: a global emerging threat to public health systems / M. Ferri, E. Ranucci, P. Romagnoli [et al.] // Crit Rev Food Sci Nutrit. 2017. 57. P. 2857–2876. https://doi.org/10.1080/10408398.2015.1077192
