Ульяновск, Россия
Ульяновск, Россия
Ульяновск, Россия
Ульяновск, Россия
Ульяновск, Россия
Ульяновск, Россия
Выделение природного химозина сопряжено с этическими проблемами и высокими экономическими затратами. В связи с этим цель нашего исследования – очистка рекомбинантного химозина Camelus dromedarius (rChn-Cam), полученного в экспрессионной системе Pichia pastoris, с оптимизацией к росту клеточных колоний к различным питательным средам в присутствии различных концентраций зеоцина и анализ ферментативной активности. Последовательность гена прохимозина получена из NCBI BLAST. В качестве штамма-продуцента использовали GS115/his4 P. рastoris. Для конструирования экспрессионной кассеты использовали вектор pPICZ(alpha)B с промотором AOXI. В работе применяли генно-инженерные методы; культивирование штамма; выделение рекомбинантных His-Tag-меченных белков методом металл-аффинной хроматографии, ПААГ-электрофореза и Western-blot анализ. Молекулярную массу определяли методом MALDI-TOF MS, концентрацию – спектрофотометрически. После разработки челночной экспрессионной плазмиды pPICZ(alpha)B/proCYM_camel_pp_IDT отмечено, что наращивание клеточной массы P. рastoris GS115/his4 (фенотип Mut+) целесообразнее проводить с предварительным внесением 0,5 % метанола. После трансформации P. pastoris GS115/his4 и получения штамма-продуцента P. рastoris/pPICZ(alpha)B/proCYM_camel_pp_IDT отмечена сопряженность между скоростью прироста клеточной массы и концентрациями зеоцина в среде YPD («не обогащенная» с 50, 100 и 200 мкг/мл зеоцина) и YPD («обогащенная», биотин 0,00004 % и 1 % глицерина, с 50, 100 и 200 мкг/мл зеоцина), согласно которой штамм-продуцент целесообразно выращивать в «обогащенной» среде с концентрацией зеоцина 50 мкг/мл. После выделения и очистки масса rChn-Cam составила 35,673 кДа. При повышении рН субстрата с 5,0 до 6,5 коагуляционная активность снижалась на 24 %. Порог термической инактивации rChn-Cam составил 40–45 °C. Единица активности свертываемости снижается при увеличении концентрации зеоцина. Выявлена противоположная зависимость концентрации rChn-Cam от времени начала свертывания субстрата. Таким образом, полученный нами rChn-Cam в экспрессионной системе P. рastoris является хорошей альтернативой rChn, который используется при производстве сыров.
генетическая конструкция, рекомбинантный химозин, Camelus dromedarius, вектор, плазмида, дрожжи Pichia pastoris, молокосвертывающая активность, термостабильность, очистка химозина
1. Foltmann, B. Prochymosin and chymosin (prorennin and rennin) / B. Foltmann // Biochemical Journal. 1969. № 115. P. 3–4. https://doi.org/10.1042/bj1150003p
2. Wang, N. Expression and characterization of camel chymosin in Pichia pastoris / N. Wang [et al.] // Protein Expression and Purification. 2015. № 111. P. 75–81. https://doi.org/10.1016/j.pep.2015.03.012
3. Uniacke-Lowe, T. Chymosin, pepsins and other aspartyl proteinases: Structures, functions, catalytic mechanism and milk-clotting properties // Cheese. Chemistry, Physics and Microbiology / T. Uniacke-Lowe, P. F. Fox. – UK: Academic Press, 2017. – Р. 69–113. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-417012-4.00004-1
4. Akishev, Z. Obtaining of recombinant camel chymosin and testing its milk-clotting activity on cow’s, goat’s, ewes’, camel’s and mare’s milk / Z. Akishev, S. Aktayeva, A. Kiribayeva // Biology. 2022. № 11. e1545. https://10.3390/biology11111545
5. Мягконосов, Д. С. Протеолитическая активность молокосвертывающих ферментов разного происхождения / Д. С. Мягконосов, Д. В. Абрамов, И. Н. Делицкая, Е. Г. Овчинникова // Пищевые системы. 2022. Т. 5, № 1. С. 47–54. https://doi.org/10.21323/2618-9771-2022-5-1-47-54; https://elibrary.ru/fkaojb
6. Akishev, Zh. Milk-clotting activity of recombinant bovine and camel chymosin for cow's, goat's and ewes' milk / Zh. Akishev [et al.] // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2023. № 2. P. 61–68. https://doi.org/10.11134/btp.2.2023.8; https://elibrary.ru/ukhqoj
7. Balabova, D. V. Biochemical properties of a promising milk-clotting enzyme, Moose (Alces alces) recombinant chymosin / D. V. Balabova [et al.] // Foods. 2023. Vol. 12. № 20. e3772. https://doi.org/10.3390/foods12203772
8. Мурашкин, Д. Е. Анализ некоторых биохимических свойств рекомбинантного химозина сибирской косули (Capreolus pygargus), полученного в культуре клеток млекопитающих (CHO-K1) / Д. Е. Мурашкин, С. В. Беленькая, А. А. Бондарь [и др.] // Биохимия. 2023. Т. 88. Вып. 9. С. 1556–1569. https://doi.org/10.31857/S0320972523090087; https://elibrary.ru/wwnnwk
9. Gilliland, G. L. The three-dimensional structure of recombinant bovine chymosin at 2.3 Å resolution / G. L. Gilliland [et al.] // Proteins. 1990. № 8. P. 82–101. https://doi.org/10.1002/prot.340080110
10. Holt, C. Invited review: Caseins and the casein micelle: Their biological functions, structures, and behavior in foods // C. Holt [et al.] // Journal of Dairy Science. 2013. № 96. P. 6127–6146. https://doi.org/10.3168/jds.2013-6831
11. Lopes-Marques, M. Unusual loss of chymosin in mammalian lineages parallels neo-natal immune transfer strategies / M. Lopes-Marques, R. Ruivo, E. Fonseca // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2017. № 116. P. 78–86. https://doi.org/10.1016/j.ympev.2017.08.014
12. Akishev, Z. Constitutive expression of Camelus bactrianus prochymosin B in Pichia pastoris / Z. Akishev [et al.] // Heliyon. 2021. Vol. 7(5). e07137. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e07137
13. Flamm, E. L. How FDA approved chymosin: A case history / E. L. Flamm // BioTechnology. 1991. № 9. P. 349–351. https://doi.org/10.1038/nbt0491-349
14. Johnson, M. E. A 100-Year Review: Cheese production and quality / M. E. Johnson // Journal of Dairy Science. 2017. № 100. P. 9952–9965. https://doi.org/10.3168/jds.2017-12979
15. Balabova, D. V. Biochemical and technological properties of moose (Alces alces) recombinant chymosin / D. V. Balabova, A. P. Rudometov, S. V. Belenkaya // Journal of Genetics and Breeding. 2022. Vol. 26, № 3. P. 240–249. https://doi.org/10.18699/VJGB-22-31; https://elibrary.ru/wnatqw
16. da Silva, R. R. Evaluation of the milk clotting properties of an aspartic peptidase secreted by Rhizopus microspores // R. R. da Silva [et al.] // Preparative Biochemistry and Biotechnology. 2020.Vol. 50(3). P. 226-233. https://doi.org/10.1080/10826068.2019.1683861
17. Bansal, N. Suitability of recombinant camel (Camelus dromedarius) chymosin as a coagulant for Cheddar cheese / N. Bansal [et al.] // International Dairy Journal. 2009. Vol. 19 (9). P. 510–517. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2009.03.010
18. Moynihan, A. C. Effect of camel chymosin on the texture, functionality, and sensory properties of low-moisture, part-skim Mozzarella cheese / A. C. Moynihan // Journal of Dairy Science. 2014. Vol. 97(1). P. 85–96. https://doi.org/10.3168/jds.2013-7081
19. González-Velázquez, D. A. Exploring the milk-clotting and proteolytic activities in different tissues of Vallesia glabra: a new source of plant proteolytic enzymes / D. A. González-Velázquez [et al.] // Applied Biochemistry and Biotechnology. 2021. Vol. 193. P. 389–404. https://doi.org/10.1007/s12010-020-03432-5
20. Sbhatu, D. B. Ficus palmata FORSKÅL (BELES ADGI) as a source of milk clotting agent: a preliminary research / D. B. Sbhatu, H. T. Tekle, K. H. Tesfamariam // BMC Research Notes. 2020. Vol. 13. P. 446. https://doi.org/10.1186/s13104-020-05293-x
21. Беленькая, С. В. Разработка продуцента рекомбинантного химозина марала на основе дрожжей Kluyveromyces lactis / С. В. Беленькая, В. В. Ельчанинов, Д. Н. Щербаков // Биотехнология. 2021. Т. 37, № 5. С. 20–27. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2021-37-5-20-27; https://elibrary.ru/qzyxec
22. Синицын, А. П. Получение промышленно важных ферментов на основе экспрессионной системы гриба Penicillium verruculosum / А. П. Синицын, О. А. Синицына, А. М. Рожкова // Биотехнология. 2020. Т. 36. № 6. С. 17–34. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2020-36-6-17-34; https://elibrary.ru/qyxxah
23. Baghban, R. Yeast expression systems: overview and recent advances / R. Baghban [et al.] // Molecular Biotechnology. 2019. Vol. 61(5). P. 365–384. https://doi.org/10.1007/s12033-019-00164-8
24. Patra, P. Recent advances in systems and synthetic biology approaches for developing novel cell-factories in non-conventional yeasts / P. Patra [et al.] // Biotechnology Advances. 2021. № 47. e107695. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2021.107695
25. Jensen, J. L. Camel and bovine chymosin: the relationship between their structures and cheese-making properties / J. L. Jensen [et al.] // Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 2013. Vol. 69. P. 901–913. https://doi.org/10.1107/S0907444913003260
26. Fox, P. F. Enzymatic coagulation of milk // Fundamentals of Cheese Science / P. F. Fox [et al.]. New York: Springer, 2017. – P. 185–229. https://doi.org/10.1007/978-1-4899-7681-9_7
27. Беленькая, С. В. Основные биохимические свойства рекомбинантных химозинов (обзор) / С. В. Беленькая, Д. В. Балабова, А. Н. Белов [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2020. Т. 56, № 4. С. 315–326. https://doi.org/10.31857/S0555109920040030; https://elibrary.ru/ahzlih
28. Gumus, P. Effects of blends of camel and calf chymosin on proteolysis, residual coagulant activity, microstructure, and sensory characteristics of Beyaz peynir / P. Gumus, A. A. Hayaloglu // Journal of Dairy Science. 2019. Vol. 102(7). P. 5945–5956. https://doi.org/10.3168/jds.2018-15671
29. Al-Zoreky, N. S. Using recombinant camel chymosin to make white soft cheese from camel milk // N. S. Al-Zoreky, F. S. Almathen // Food Chemistry. 2021. № 337. e127994. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.127994
30. Беленькая, С. В. Разработка продуцента рекомбинантного химозина марала на основе дрожжей Kluyveromyces lactis / С. В. Беленькая, В. В. Ельчанинов, Д. Н. Щербаков // Биотехнология. 2021. Т. 37. № 5. С. 20–27. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2021-37-5-20-27; https://elibrary.ru/qzyxec
31. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. 1970. Vol. 227(5259). P. 680–685. https://doi.org/10.1038/227680a0
32. Рудометов, А. П. Исследование ферментативной стабильности жидких препаратов рекомбинантного химозина коровы (Bos taurus taurus L.) / А. П. Рудометов, С. В. Беленькая, Д. Н. Щербаков [et al.] // Сыроделие и маслоделие. 2017. № 6. С. 40–43. https:// elibrary.ru/zudmcr
33. Ageitos, J. M. Purification and characterization of a milk-clotting protease from Bacillus licheniformis strain USC13 / J. M. Ageitos [et al.] // Journal of Applied Microbiology. 2007. № 103(6). P. 2205–2213. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2007.03460.x
34. Malik, A. A review on Pichia pastoris: A successful tool for expression of recombinant proteins / A. Malik, A. Gupta, S. Dahiya [et al.] // The Pharma Innovation Journal. 2021. Vol. 10(11). P. 550–556.
