ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ИЗОЛЯТЫ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ В ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОМАНАЛИЗЕ ПО ГЕНУ B602L
Аннотация и ключевые слова
Аннотация (русский):
Вирус африканской чумы свиней имеет свои генетические механизмы изменчивости. Большой интерес для научного сообщества представляет проблема эволюционной изменчивости генома вируса АЧС. А именно проблема эволюционной изменчивости генома вируса АЧС, изучение функций отдельных генов, их роли во взаимодействии с клеткой – хозяином и влияние на эволюционную изменчивость, как самого вируса, так и восприимчивого организма. Разнообразие генетических вариантов вируса является главным свойством этого возбудителя, а также отсутствие вакцины против данной болезни. Имея данные о генетической особенности вируса АЧС, а также изучении вариабельности известных генов позволяют расширить сведения о характере генетических изменений, а также получить молекулярно-эпизоотологическую картину циркуляции вируса АЧС как на территории Российской Федерации, так и в мире в целом. Анализ ряда маркерных генов позволят комплексно оценить генетические изменения вируса АЧС и их возможные фенотипические проявления. Изучение гена B602L позволяет более точно проводить дифференциацию европейских и азиатских изолятов внутри одного генотипа. Проведен филогенетический анализ по гену B602Lшестидесяти отечественных изолятоввируса АЧС выделенных на территории Российской Федерации с 2016 по 2017 гг.В результате исследования, использованные, в работе изоляты удалось разбить на два кластера. Анализ полученных данных показал высокую консервативность изолятов и штаммов и позволил установить их генотипическую принадлежность. До сих пор остается не выясненным характер генетических и фенотипических изменений в геноме вируса АЧС.

Ключевые слова:
африканская чума свиней, изоляты, ген, филогенетическое древо, домашние свиньи, дикие кабаны
Текст
Текст произведения (PDF): Читать Скачать

Введение. Африканская чума свиней (АЧС) – это контагиозная вирусная болезнь, поражающая домашних свиней и диких кабанов всех пород и возрастов. Это ДНК содержащий вирус, относящийся к семейству Asfiviridaeи роду Asfivirus [13, 16].

Летальность у восприимчивых животных достигает 100% (высокая степень патогенности) [21]. Это заболевание оказывает разрушительные последствия для мировой свиноводческой отрасли, поскольку влечет за собой огромные экономические потери, складывающиеся из затрат на проведение карантинных и ветеринарно – санитарных мероприятий (убой всего поголовья) на территории очага болезни [1].

Вирус АЧС является катастрофой для любой страны. Поскольку в настоящее время вирус АЧС продолжает распространяться  и регистрироваться в новых европейских, азиатских странах являющихся ранее благополучными. Циркуляция вируса АЧС среди домашних свиней, а также попадание вируса в дикую природу к кабанам усложняет ликвидацию заболевания [6, 12].

На сегодняшний день до сих пор не разработана безопасная и эффективная коммерческая вакцина против АЧС [7, 10, 20]. Вирус АЧС обладает большой  эволюционной скоростью изменчивости (3,31 × 10−4 замен/позиция/год с  экспоненциальным ростом 0,01 в год-1) по сравнению с другими крупными ДНК содержащими вирусами АЧС [3]. Изоляты вируса АЧС различаются по своим биологическим свойствам, поэтомувопрос их группирования и классификации, а также генотипирования и сероиммунотиповой идентификации является главенствующим [2, 4, 5].

Генетическую вариабельность вируса АЧС изучают методом секвенирования определенных фрагментов геномов или проведение полногеномного и сравнения их с известными изолятами и штаммами.

Цель исследованияпровести филогенетический анализ отечественных изолятов вируса африканской чумы свиней по гену B602L.

Условия, материалы и методы. Исследования проводились на базе ФГБНУ «Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии». Объектами исследования являлись 60 отечественных изолятов вируса АЧС выделенных на территории Российской Федерации с 2016 по 2017 гг. Во всех исследованных образцах было показано наличие генома вируса АЧС при исследовании методом ПЦР в режиме реального времени.

Выделение ДНК осуществляли набором «Рибо-сорб» (Интерлабсервис, Россия), согласно инструкции производителя.Реакцию ПЦР проводили в амплификаторе «MaxyGeneGradient», (США). Температурный режим и количество циклов для прибора «СFX96Touch» составлял: 3 мин денатурации при температуре 94°C; отжиг праймеров при 53°C –30 сек, элонгация при 72°C – 45 сек. (40 циклов).

Анализ ДНК осуществляли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле, содержащем 0,001% интеркалирующего красителя бромистого этидия. Электрофорез проводили при силе тока 50 мА и напряжении 150 В в течение 40 минут. ДНК визуализировали на гель-документирующей системе «ChemiDoc MP» («Bio-RadLaboratories», США) в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм.Очистка полученных из геля ПЦР-продуктов осуществлялась с применением набора “Cleanup - standard” (Евроген, Россия). Набором Bigdyeterminator v3.1 (Applied Biosystems, США) проводилась сиквенсовая реакция в соответствии с инструкцией производителя. Секвенирование нуклеотидных последовательностей гена B602L, вируса АЧС проводили с использованием специфических для определѐнного фрагмента генома праймеров:

ORF9L-F1 (5'AATGCGCTCAGGATCTGTTAAATCGG3');

ORF9L-R2 (5'TCTTCATGCTCAAAGTGCGTATACCT3') [9].

Далее полученные нуклеотидные последовательности фрагментов гена вируса АЧС собирали и выравнивали с использованием компьютерной программы  «BioEdit v.7» [15]. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями гена вируса АЧС взятых из базы данных «GenBank» с использованием программы «BLASTN» (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)[8].

Для построения дендрограммы применяли метод «Bootstrap» (максимального правдоподобия) с анализом 1000 случайных выборок, с использованием программы «Mega 7.0» [17].

Результаты и обсуждения. Наиболее известным и информативным маркером для изучения генетического разнообразия между отечественными изолятами и штаммами вируса АЧС считается ген B602L. Он часто используется в молекулярно-генетических исследованиях. Этот маркерный генпозволяет более точно выявлять филогенетические взаимоотношения между штаммамивируса АЧС.

Ген B602L (CVR) располагается в центральной вариабельной области генома. Является наиболее вариабельным участком генома и содержит повторы длиной 12 п.н. В гене B602L локализовано большое количество повторяющихся аминокислотных тетрамеров они варьируются по количеству и составу у различных штаммов и изолятов вируса АЧС [14, 22].

В настоящее время известно, что все исследованные отечественные  изоляты выделенные на территории Российской Федерации имеют только один из вариантов центральной вариабельной области гена B602L(CVR1) [19].

Следует отметить, что у эстонских изолятов второго генотипа выделенных в популяции дикого кабана, были обнаружены два генетических варианта (CVR-1 и CVR-2), содержащих семь и десять тетрамеров [18].

До сих пор неизвестны причины вариабельности гена B602L однако имеются данные о том, что белок pB602L кодируемый таким же геном принимает участие в корректировке правильности  формирования вторичных и третичных структур капсидного белка p72 и является неструктурным белком, который исключен из процесса репликации вируса АЧС [22].

Этот ген, как и многие другие, позволяет выявить изменения среди изолятов вируса АЧС. Поэтому для определения филогенетического родства отечественных изолятов выделенных на территории Российской Федерации с 2016 по 2017 гг. нами была определена нуклеотидная последовательность этого гена.

С целью определения филогенетических отношений изолятов и штаммов вируса, отечественных изолятов вируса АЧС выделенных в 2016 по 2017 гг. и данных взятых из «GenBank» был проведен филогенетический анализ на основе нуклеотидных последовательностей гена B602L с использованием статистического метода «максимального правдоподобия». (рис. 1). Анализ изолятов вируса АЧС проводился программой «MEGA v.5.2». Построенная дендрограмма отражает филогенетические отношения штаммов и изолятов из стран Европы и Азии, представляющие II генотип вируса (табл. 1).

 

Таблица 1 –  Изоляты вируса АЧС из стран Европы и Азии, взятые из генбанка и использованные при построении филогенетического древа по гену B602L

Код штамма вируса

Страна

Выделен от

Год

Генотип

Код последовательности в Генбанк

Georgia 2007/1

Грузия

Дикий кабан

2007

II

FR682468.2

Belgium/Estalle /wb/2018

Бельгия

Свиньи

2019

II

MK543947

Belgium 2018/1

Бельгия

Свиньи

2019

II

LR536725

Estonia 2014

Эстония

Свиньи

2014

II

LS478113

Wuhan 2019-2

Китай

Свиньи

2019

II

MN393477

China/2018/AnhuiXGO

Китай

Свиньи

2018

II

MK128995

Pig/HlJ/2018

Китай

Свиньи

2018

II

MK333180

 

Также для сравнения изолятов нами был выбран референс –  штамм референс-штаммом «Georgia 2007/1» (FR682468.2), который впервые был обнаружен в 2007 году.

Согласно филогенетическому анализу по гену B602L все исследованные изоляты и штаммы вируса АЧС по степени гомологии разделились на два кластера. Так, сорок восемь изолятов отечественного происхождения были сгруппированы в один кластер с изолятами и штаммами из стран Европы и Азии. Анализ нуклеотидных последовательностей этих изолятов показал высокую консервативность (100 % гомология).

Рисунок 1 – Филогенетическое древо, построенное по методу «Bootstrap (максимального правдоподобия)» на основании данных нуклеотидных последовательностей B602Lизолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ с 2016 г. по 2019 г.

 

Во втором кластере представлены двенадцать отечественных изолятов, их группообразование произошло благодаря имеющимся идентичным единичным заменам в нуклеотидной последовательности.

Выводы. Таким образом, согласно проведенному филогенетическому анализу по гену B602L удалось установить, что выделенные на территории Российской Федерации отечественные изоляты с 2016 по 2017 года оказались идентичными (100% гомология) и принадлежат ко второму генотипу.В дальнейшем обнаружение большого количества новых изолятов с генетическими мутациями в нуклеотидных последовательностях по гену B602L позволит провести их дифференциацию.

 

Работа выполнена при поддержки гранта Президента РФ МК-2000.2017.11 от 22.02.17.

Список литературы

1. Африканская чума свиней на территории Российской Федерации: экономические последствия / В.М. Гуленкин, И.М. Клиновицкая, О.Н. Петрова и др. // Ветеринария сегодня. 2017. №4. С.23-27.

2. Белянин С. А., Васильев А. П., Колбасов Д. В. Вирулентность изолятов вируса африканской чумы свиней / // Ветеринария Кубани. 2011. №5. С. 9-10.

3. Вирус африканской чумы свиней: использование генетических маркеров при анализе путей его распространения / А. Мазлум, А.С. Иголкин, Н.Н. Власова и др. // Ветеринария сегодня. 2019. №3. С. 3-14. doihttps://doi.org/10.29326/2304-196X-2019-3-30-3-8.

4. Принципы классификации изолятов вируса африканской чумы свиней/ И.Ф. Вишняков, A.B. Киселёв, Ю.И. Петров и др. // Актуальные проблемы вирусологии: тезисы докладов научной конференции. п. Гвардейский: Институт микробиологии и вирусологии Национальной академии наук. 1994. С.25-26.

5. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней / И.Ф. Вишняков, Н.И. Митин, Ю.И. Петров и др. // Актуальные вопр. ветеринарной вирусологии: материалы науч.-практ. конф. «Классическая чума свиней - неотложные проблемы науки и практики». Покров: ВНИИВВиМ, 1995. С. 141-143.

6. Структура современного ареала распространения африканской чумы свиней в Российской Федерации / В. А.Журавлева, В.М. Лыска, А.П. Васильев и др. // Ветеринария. 2017. №11.С. 1-8.

7. African swine fever virus multigene family 360 and 530 genes affect host interferon response / C.L. Afonso, M.E. Piccone, K.M. Zaffuto // J Virol 78:1858-1864. doi:https://doi.org/10.1128/JVI.78.4.1858-1864.2004.

8. A greedy algorithm for aligning DNA sequences / Z. Zhang, S. Schwartz, L.Wagner et al. // Journal of Computational Biology. 2000. Vol. 7. P. 203-214. DOI:https://doi.org/10.1089/10665270050081478.

9. Amino acid tandem repeats within a late viral gene define the central variable region of African swine fever virus / P.M. Irusta, M.V. Borca, G.F. Kutish et al. // Virology. 1996. Vol. 220. P. 20 - 27. DOIhttps://doi.org/10.1006/viro.1996.0281.

10. Approaches and perspectives for development of african swine fever virus vaccines/ M.Arias, Torre de la, A.Dixon et al. // Vaccines. 2017. Vol. 5, N 4. P.1-20.

11. African swine fever virus replication and genomics/ L.K. Dixon, D.A. Chapman, C.L. Netherton et al. // Virus Res. 2013. Vol.173. P. 3-14. DOIhttps://doi.org/10.1016/j.virusres.2012.10.020.

12. Characterization of African swine fever virus Caucasus isolate in European wild boars / C. Gabriel, S. Blome, A. Malogolovkin et al. // Emerg. Infect. Dis. 2011. Vol. 17. № 12. P. 2342-2345.

13. Dixon L. K., Costa J. V., Escribano J. M. Family Asfarviridae. Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses // San Diego. 2000. P. 159 -165.

14. Gallardo C., Mwaengo D. M., Macharia J. M. Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72 and pB602L (CVR) genes // Virus Genes. 2009. Vol. 38. N 1. P. 85-95.

15. Hall T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucleic Acids Symp. Ser. 1999. Vol. 41. Р. 95-98. DOIhttps://doi.org/10.14601/Phytopathol_Mediterr-14998u1.29.

16. Immunization of pigs by DNA prime and recombinant vaccinia virus boost to identify and rank african swine fever virus immunogenic and protective proteins/ J. K. Jancovich, D. Chapman, D.T. Hansen // Journal of Virology. 2018. Vol. 92. N 8. Р. 19-17.

17. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 / K. Tamura, G. Stecher, D.Peterson et al. // Mol. Biol. Evol. 2013. Vol. 30. № 12.Р. 2725 - 2729.DOI:https://doi.org/10.1093/molbev/mst197.

18. Molecular characterization of African swine fever virus (ASFV) isolates circulating in the Eastern European Union countries 2014-2016/ R. Nieto, A. Soler, I. Nurmoja et al. // Proc. 10th Annual Meeting EPIZONE, 27-29 September 2016. Madrid, 2016. P. 164.DOIhttps://doi.org/10.3390/pathogens9070582.

19. Molecular epidemiology of African swine fever virus studied by analysis of four variable genome regions / R.J. Nix, C. Gallardo, G. Hutchings et al. //Arch Virol. 2006. Vol.151. N 12. P.2475 - 2494.

20. Revilla Y. Perez-Nunez Y.D., Richt J.A. African Swine Fever Virus Biology and Vaccine Approaches // Adv Virus Res. 2018. Vol. 100. P. 41 - 74.

21. Sanchez-Vizcaino J.M. African swine fever // Diseases of Swine. - 9th ed. - Ames, Iova. 2006. P. 93 - 102.

22. The African swine fever virus nonstructural protein pB602L is required for formation of the icosahedral capsid of the virus particle/ C. Epifano, J. Krijnse-Locker, M. L. Salas et al. //J. Virol.2006.P. 12260-12270.DOI:https://doi.org/10.1128/JVI.01323-06.

Войти или Создать
* Забыли пароль?