UDK 577.21 Молекулярные механизмы кодирования, запасания и реализации наследственной информации. Молекулярная биология гена (молекулярная генетика). Молекулярные механизмы матричного синтеза (биополимеризация)
African swine fever virus has its own genetic mechanisms of variability. Of great interest to the scientific community is the problem of the evolutionary variability of the ASF virus genome. Namely, the problem of the evolutionary variability of the ASF virus genome, the study of the functions of individual genes, their role in interaction with the host cell and the impact on the evolutionary variability of both the virus itself and the susceptible organism. The diversity of genetic variants of the virus is the main property of this pathogen, as well as the lack of a vaccine against this disease. Having data on the genetic features of the ASF virus, as well as the study of the variability of known genes, allow us to expand information about the nature of genetic changes, as well as to obtain a molecular epizootological picture of the circulation of the ASF virus both in the Russian Federation and in the world as a whole. Analysis of a number of marker genes will make it possible to comprehensively assess the genetic changes in the ASF virus and their possible phenotypic manifestations. The study of the B602L gene allows more accurate differentiation of European and Asian isolates within the same genotype. Phylogenetic analysis for the B602L gene of sixty domestic isolates of the ASF virus isolated in the Russian Federation from 2016 to 2017 was carried out. As a result of the study, the isolates used in the work were divided into two clusters. Analysis of the obtained data showed the high conservation of isolates and strains and made it possible to establish their genotypic affiliation. The nature of genetic and phenotypic changes in the genome of the ASF virus still remains unclear.
african swine fever, isolates, gene, phylogenetic tree, domestic pigs, wild boars
Введение. Африканская чума свиней (АЧС) – это контагиозная вирусная болезнь, поражающая домашних свиней и диких кабанов всех пород и возрастов. Это ДНК содержащий вирус, относящийся к семейству Asfiviridaeи роду Asfivirus [13, 16].
Летальность у восприимчивых животных достигает 100% (высокая степень патогенности) [21]. Это заболевание оказывает разрушительные последствия для мировой свиноводческой отрасли, поскольку влечет за собой огромные экономические потери, складывающиеся из затрат на проведение карантинных и ветеринарно – санитарных мероприятий (убой всего поголовья) на территории очага болезни [1].
Вирус АЧС является катастрофой для любой страны. Поскольку в настоящее время вирус АЧС продолжает распространяться и регистрироваться в новых европейских, азиатских странах являющихся ранее благополучными. Циркуляция вируса АЧС среди домашних свиней, а также попадание вируса в дикую природу к кабанам усложняет ликвидацию заболевания [6, 12].
На сегодняшний день до сих пор не разработана безопасная и эффективная коммерческая вакцина против АЧС [7, 10, 20]. Вирус АЧС обладает большой эволюционной скоростью изменчивости (3,31 × 10−4 замен/позиция/год с экспоненциальным ростом 0,01 в год-1) по сравнению с другими крупными ДНК содержащими вирусами АЧС [3]. Изоляты вируса АЧС различаются по своим биологическим свойствам, поэтомувопрос их группирования и классификации, а также генотипирования и сероиммунотиповой идентификации является главенствующим [2, 4, 5].
Генетическую вариабельность вируса АЧС изучают методом секвенирования определенных фрагментов геномов или проведение полногеномного и сравнения их с известными изолятами и штаммами.
Цель исследования – провести филогенетический анализ отечественных изолятов вируса африканской чумы свиней по гену B602L.
Условия, материалы и методы. Исследования проводились на базе ФГБНУ «Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии». Объектами исследования являлись 60 отечественных изолятов вируса АЧС выделенных на территории Российской Федерации с 2016 по 2017 гг. Во всех исследованных образцах было показано наличие генома вируса АЧС при исследовании методом ПЦР в режиме реального времени.
Выделение ДНК осуществляли набором «Рибо-сорб» (Интерлабсервис, Россия), согласно инструкции производителя.Реакцию ПЦР проводили в амплификаторе «MaxyGeneGradient», (США). Температурный режим и количество циклов для прибора «СFX96Touch» составлял: 3 мин денатурации при температуре 94°C; отжиг праймеров при 53°C –30 сек, элонгация при 72°C – 45 сек. (40 циклов).
Анализ ДНК осуществляли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле, содержащем 0,001% интеркалирующего красителя бромистого этидия. Электрофорез проводили при силе тока 50 мА и напряжении 150 В в течение 40 минут. ДНК визуализировали на гель-документирующей системе «ChemiDoc MP» («Bio-RadLaboratories», США) в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм.Очистка полученных из геля ПЦР-продуктов осуществлялась с применением набора “Cleanup - standard” (Евроген, Россия). Набором Bigdyeterminator v3.1 (Applied Biosystems, США) проводилась сиквенсовая реакция в соответствии с инструкцией производителя. Секвенирование нуклеотидных последовательностей гена B602L, вируса АЧС проводили с использованием специфических для определѐнного фрагмента генома праймеров:
ORF9L-F1 (5'AATGCGCTCAGGATCTGTTAAATCGG3');
ORF9L-R2 (5'TCTTCATGCTCAAAGTGCGTATACCT3') [9].
Далее полученные нуклеотидные последовательности фрагментов гена вируса АЧС собирали и выравнивали с использованием компьютерной программы «BioEdit v.7» [15]. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями гена вируса АЧС взятых из базы данных «GenBank» с использованием программы «BLASTN» (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)[8].
Для построения дендрограммы применяли метод «Bootstrap» (максимального правдоподобия) с анализом 1000 случайных выборок, с использованием программы «Mega 7.0» [17].
Результаты и обсуждения. Наиболее известным и информативным маркером для изучения генетического разнообразия между отечественными изолятами и штаммами вируса АЧС считается ген B602L. Он часто используется в молекулярно-генетических исследованиях. Этот маркерный генпозволяет более точно выявлять филогенетические взаимоотношения между штаммамивируса АЧС.
Ген B602L (CVR) располагается в центральной вариабельной области генома. Является наиболее вариабельным участком генома и содержит повторы длиной 12 п.н. В гене B602L локализовано большое количество повторяющихся аминокислотных тетрамеров они варьируются по количеству и составу у различных штаммов и изолятов вируса АЧС [14, 22].
В настоящее время известно, что все исследованные отечественные изоляты выделенные на территории Российской Федерации имеют только один из вариантов центральной вариабельной области гена B602L(CVR1) [19].
Следует отметить, что у эстонских изолятов второго генотипа выделенных в популяции дикого кабана, были обнаружены два генетических варианта (CVR-1 и CVR-2), содержащих семь и десять тетрамеров [18].
До сих пор неизвестны причины вариабельности гена B602L однако имеются данные о том, что белок pB602L кодируемый таким же геном принимает участие в корректировке правильности формирования вторичных и третичных структур капсидного белка p72 и является неструктурным белком, который исключен из процесса репликации вируса АЧС [22].
Этот ген, как и многие другие, позволяет выявить изменения среди изолятов вируса АЧС. Поэтому для определения филогенетического родства отечественных изолятов выделенных на территории Российской Федерации с 2016 по 2017 гг. нами была определена нуклеотидная последовательность этого гена.
С целью определения филогенетических отношений изолятов и штаммов вируса, отечественных изолятов вируса АЧС выделенных в 2016 по 2017 гг. и данных взятых из «GenBank» был проведен филогенетический анализ на основе нуклеотидных последовательностей гена B602L с использованием статистического метода «максимального правдоподобия». (рис. 1). Анализ изолятов вируса АЧС проводился программой «MEGA v.5.2». Построенная дендрограмма отражает филогенетические отношения штаммов и изолятов из стран Европы и Азии, представляющие II генотип вируса (табл. 1).
Таблица 1 – Изоляты вируса АЧС из стран Европы и Азии, взятые из генбанка и использованные при построении филогенетического древа по гену B602L
|
Код штамма вируса |
Страна |
Выделен от |
Год |
Генотип |
Код последовательности в Генбанк |
|
Georgia 2007/1 |
Грузия |
Дикий кабан |
2007 |
II |
FR682468.2 |
|
Belgium/Estalle /wb/2018 |
Бельгия |
Свиньи |
2019 |
II |
MK543947 |
|
Belgium 2018/1 |
Бельгия |
Свиньи |
2019 |
II |
LR536725 |
|
Estonia 2014 |
Эстония |
Свиньи |
2014 |
II |
LS478113 |
|
Wuhan 2019-2 |
Китай |
Свиньи |
2019 |
II |
MN393477 |
|
China/2018/AnhuiXGO |
Китай |
Свиньи |
2018 |
II |
MK128995 |
|
Pig/HlJ/2018 |
Китай |
Свиньи |
2018 |
II |
MK333180 |
Также для сравнения изолятов нами был выбран референс – штамм референс-штаммом «Georgia 2007/1» (FR682468.2), который впервые был обнаружен в 2007 году.
Согласно филогенетическому анализу по гену B602L все исследованные изоляты и штаммы вируса АЧС по степени гомологии разделились на два кластера. Так, сорок восемь изолятов отечественного происхождения были сгруппированы в один кластер с изолятами и штаммами из стран Европы и Азии. Анализ нуклеотидных последовательностей этих изолятов показал высокую консервативность (100 % гомология).
Рисунок 1 – Филогенетическое древо, построенное по методу «Bootstrap (максимального правдоподобия)» на основании данных нуклеотидных последовательностей B602Lизолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ с 2016 г. по 2019 г.
Во втором кластере представлены двенадцать отечественных изолятов, их группообразование произошло благодаря имеющимся идентичным единичным заменам в нуклеотидной последовательности.
Выводы. Таким образом, согласно проведенному филогенетическому анализу по гену B602L удалось установить, что выделенные на территории Российской Федерации отечественные изоляты с 2016 по 2017 года оказались идентичными (100% гомология) и принадлежат ко второму генотипу.В дальнейшем обнаружение большого количества новых изолятов с генетическими мутациями в нуклеотидных последовательностях по гену B602L позволит провести их дифференциацию.
Работа выполнена при поддержки гранта Президента РФ МК-2000.2017.11 от 22.02.17.
1. African swine fever in the Russian Federation: economic consequences / V.M. Gulenkin, I.M. Klinovitskaya, O.N. Petrova and others // Veterinary science today. 2017. No. 4. S.23-27.
2. Belyanin S. A., Vasiliev A. P., Kolbasov D. V. Virulence of African swine fever virus isolates // Veterinary of Kuban. 2011. No. 5. pp. 9-10.
3. African swine fever virus: the use of genetic markers in the analysis of its spread / A. Mazlum, A.S. Igolkin, N.N. Vlasova and others // Veterinary science today. 2019. №3. pp. 3-14. doihttps://doi.org/10.29326/2304-196X-2019-3-30-3-8.
4. Principles of classification of African swine fever virus isolates / I.F. Vishnyakov, A.B. Kiselev, Yu.I. Petrov et al. // Actual problems of virology: abstracts of scientific conference reports. Settlement Guards: Institute of Microbiology and Virology of the National Academy of Sciences. 1994. S.25-26.
5. Seroimmunological classification of natural African swine fever virus isolates / I.F. Vishnyakov, N.I. Mitin, Yu.I. Petrov et al. // Topical Issues. veterinary virology: materials of scientific and practical. conf. "Classical swine fever - pressing problems of science and practice". Pokrov: VNIIVViM, 1995. S. 141-143.
6. The structure of the current distribution area of African swine fever in the Russian Federation / V.A. Zhuravleva, V.M. Lyska, A.P. Vasiliev and others // Veterinary. 2017. No. 11.S. 1-8.
7. African swine virus fever multigene family 360 and 530 genes affect host interferon response / C.L. Afonso, M.E. Piccone, K.M. Zaffuto // J Virol 78:1858-1864. doi:https://doi.org/10.1128/JVI.78.4.1858-1864.2004.
8. A greedy algorithm for aligning DNA sequences / Z. Zhang, S. Schwartz, L. Wagner et al. // Journal of Computational Biology. 2000 Vol. 7. P. 203-214. DOI:https://doi.org/10.1089/10665270050081478.
9. Amino acids tandem repeats within a late viral gene define the central variable region of African swine fever virus / P.M. Irusta, M.V. Borca, G.F. Kutish et al. // Virology. 1996 Vol. 220. P. 20 - 27. DOIhttps://doi.org/10.1006/viro.1996.0281.
10. Approaches and perspectives for development of african swine fever virus vaccines/ M.Arias, Torre de la, A.Dixon et al. // Vaccines. 2017 Vol. 5, No. 4. P.1-20.
11. African swine fever virus replication and genomics/ L.K. Dixon, D.A. Chapman, C.L. Netherton et al. // Virus Res. 2013. Vol.173. P. 3-14. DOIhttps://doi.org/10.1016/j.virusres.2012.10.020.
12. Characterization of African swine fever virus Caucasus isolate in European wild boars / C. Gabriel, S. Blome, A. Malogolovkin et al. // Emerge. Infect. Dis. 2011 Vol. 17. No. 12. P. 2342-2345.
13. Dixon L. K., Costa J. V., Escribano J. M. Family Asfarviridae. Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses // San Diego. 2000. P. 159-165.
14. Gallardo C., Mwaengo D. M., Macharia J. M. Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72 and pB602L (CVR) genes // Virus Genes. 2009 Vol. 38. No. 1. P. 85-95.
15. Hall T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucleic Acids Symp. Ser. 1999 Vol. 41. R. 95-98. DOIhttps://doi.org/10.14601/Phytopathol_Mediterr-14998u1.29.
16. Immunization of pigs by DNA prime and recombinant vaccinia virus boost to identify and rank african swine virus fever immunogenic and protective proteins/ J. K. Jancovich, D. Chapman, D.T. Hansen // Journal of Virology. 2018 Vol. 92. N 8. R. 19-17.
17. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 / K. Tamura, G. Stecher, D. Peterson et al. // Mol. Biol. Evol. 2013. Vol. 30. No. 12.R. 2725 - 2729. DOI:https://doi.org/10.1093/molbev/mst197.
18. Molecular characterization of African swine fever virus (ASFV) isolates circulating in the Eastern European Union countries 2014-2016/ R. Nieto, A. Soler, I. Nurmoja et al. //Proc. 10th Annual Meeting EPIZONE, 27-29 September 2016. Madrid, 2016. P. 164.DOIhttps://doi.org/10.3390/pathogens9070582.
19. Molecular epidemiology of African swine fever virus studied by analysis of four variable genome regions / R.J. Nix, C. Gallardo, G. Hutchings et al. //Arch Virol. 2006. Vol.151. No. 12. P.2475 - 2494.
20. Revilla Y. Perez-Nunez Y.D., Richt J.A. African Swine Fever Virus Biology and Vaccine Approaches // Adv Virus Res. 2018 Vol. 100. P. 41-74.
21. Sanchez-Vizcaino J.M. African swine fever // Diseases of Swine. - 9th ed. - Ames, Iova. 2006. P. 93 - 102.
22. The African swine fever virus nonstructural protein pB602L is required for the formation of the icosahedral capsid of the virus particle/ C. Epifano, J. Krijnse-Locker, M. L. Salas et al. //J. Virol.2006.P. 12260-12270. DOI:https://doi.org/10.1128/JVI.01323-06.
