Ижевск, Россия
Россия
Россия
Россия
УДК 62 Инженерное дело. Техника в целом. Транспорт
УДК 63 Сельское хозяйство. Лесное хозяйство. Охота. Рыбное хозяйство
ГРНТИ 68.85 Механизация и электрификация сельского хозяйства
Личинки большой восковой моли (Galleria mellonella L) – это не только серьезный вредитель пчелосемей, но и ценное сырье для производства биологически активных веществ, широко используемых в фармацевтике, косметологии, пищевой промышленности, кормах для животных, а также источник высококачественного протеина. Исследований проводили с целью разработки установки для реализации энергосберегающей световой технологии культивирования личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L) в промышленных масштабах. При их выполнении исследований разработана конструкция энергосберегающей установки для промышленного культивирования насекомых, состоящая из двух модулей: первый для бабочек (имаго), второй для личинок, куколок и яиц. Для реализации энергосберегающей световой технологии в лаборатории Удмуртского федерального исследовательского центра Уральского отделения Российской академии наук были проведены эксперименты с большой восковой молью. Повторность опытов 4-кратная, по 20 особей G.mellonella в каждой. Температуру воздуха поддерживали на уровне 28 °С, влажность – 50 %. Изучали влияние продолжительности излучения (10, 30 и 60 мин.) и длины волны (400 нм, 491 нм, 546 нм и 577 нм) на количество взрослых особей, которые перемещались в модуль для бабочек, и на массу отложенных яиц. Наиболее эффективным оказалось излучение 400 нм, так как в этом варианте в модуль для взрослых особей переместились 45 % бабочек, а масса отложенных яиц составила 32 % от общего количества, что существенно выше, чем при излучении 491, 546 и 577 нм. При длительности излучения 60 мин. в модуль для бабочек перемещалось 45 % взрослых особей большой восковой моли, 30 мин. – 44 %, 10 мин – 43 %. Поэтому время работы светодиодов с длиной волны 400 нм рекомендуется поддерживать на уровне 10 мин
большая восковая моль (Galleria mellonella), универсальный энергосберегающий модульный биореактор, энергосберегающие световые технологии
Введение. Для решения общебиологических вопросов проводят научные исследования in vivo с использованием широкого спектра модельных организмов. Отдельный интерес представляют насекомые. В частности, при изучении вирулентности и патогенеза грибов широко используют личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L.) [1]. Насекомые этого вида эволюционно приспособлены к жизни в ульях совместно с пчелиными семьями и считаются серьезными вредителями. Цикл развития G. mellonella включает следующие стадии: яйцо, личинка (гусеница), куколка (хризалида), взрослая особь (имаго) [2]. За период жизнедеятельности самки откладывают в среднем 760,9±168,88 яиц, или 161,80±45,87 яиц в день [5].
Простота размножения G. mellonella, многочисленное потомство, короткий цикл развития, известный геном и связанный с иммунитетом транскриптом делает из этого насекомого удобную исследовательскую модель для изучения иммунитета на биохимическом и молекулярном уровнях. У большой восковой моли он состоит только из врожденных механизмов и проявляет адаптивную пластичность, которая в последние годы стала предметом интенсивных научных исследований. Это насекомое служит мини-хозяином в исследованиях патогенности микроорганизмов и in vivo тестах эффективности отдельных факторов вирулентности и новых антимикробных соединений [6].
Для таких исследований личинок выращивают в лабораториях с использованием искусственных кормов и содержат в различных условиях. Вариация этих абиотических факторов может повлиять на восприимчивость модельного объекта к исследуемым веществам. Поэтому существует острая необходимость в стандартизации процедур и условий культивирования G. mellonella с целью получения качественных, не подверженных стрессу личинок с наименьшей генетической изменчивостью.
Помимо лабораторных целей личинки G. mellonella служат сырьём для производства биологически активных веществ многоцелевого назначения (фармацевтика, косметология, пищевая промышленность, стимулирующие добавки к кормам для животных) [7, 8, 9].
В последние годы насекомых все шире используют как источник высококачественного протеина [10, 11]. В этом случае необходимо культивировать большие объемы стандартизированного биоматериала, что требует отлаженной производственной цепочки. Решением таких задач занимается техническая энтомология, которая активно развивалось в СССР в конце 80-х годов [11, 12].
Технология выращивания личинок для небольших лабораторных исследований предусматривает содержание насекомых в сосудах из экологически безопасного материала (стекло, дерево, пластик), снабженных крышкой с вентиляционным отверстием, затянутым мелкоячеистой металлической сеткой [13, 14]. Объем сосуда зависит от необходимого количества личинок. По литературным данным он может составлять 0,5…8,0 л [15, 16]. Joan F. Bronskill в 1961 г. разработал специальный стеклянный сосуд для содержания личинок с двойным ячеистым дном [17]. Исследователи во главе с Н.А. Спиридоновым выращивали личинок в чашках Петри и стеклянных банках, снабженных крышками с мелкоячеистой впаянной сеткой при 20…25 °С и относительной влажности 60 % [18]. При этом на внутренней боковой поверхности модифицированной чашки Петри был расположен кольцевой выступ под углом по направлению к ее основанию, что позволяло визуально контролировать личинок, пополнять питательную среду без возможности выхода личинок и полностью устранять их травматизм [19].
При разработке устройства для культивирования насекомых в лабораторных условиях важно знать их жизненный цикл и учитывать особенности развития. Известно, что в лабораторных условиях личинок выращивают 5…6 недель, добавляя два раза в неделю свежую питательную среду [20, 21]. Разделение в новые банки обеспечивает необходимые условия питания и предотвращает переполнение, которое может вызвать стресс и обесцвечивание личиночных кутикул. Старую среду регулярно выбрасывают. Крышки очищают от паутины и окукливающихся личинок для того, чтобы улучшить перекрестную вентиляцию. Процесс окукливания G. mellonella проходит в течение 2…3 недель, после чего появляются имаго [20, 21]. На протяжении этого времени необходимо создавать благоприятные для существования насекомых условия.
Важный фактор развития и жизнедеятельности любого насекомого – питательная среда. Часть исследователей кормят личинок восковой моли естественной пищей – пчелиной сушью (выбракованные соты) или мервой (перетопленные соты) [22, 23]. К недостаткам такого субстрата относится повышенная влажность, которая влечёт за собой плесневение. Кроме того, он не сбалансирован по питательным веществам, что важно при постановке экспериментов. Поэтому разработано более 20 искусственных питательных сред для культивирования личинок G.mellonella [24, 25]. Известен ряд питательные сред зарубежных ученых [26] преимущества которых заключаются в простоте приготовления, балансе белков, жиров и углеводов.
Обеспечение необходимых параметров в лабораторных и промышленных условиях возможно посредством использования микропроцессорных систем управления для контроля температурного режима, относительной влажности воздуха, состояния и состава кормового субстрата [27, 28, 29]. На этой основе можно разрабатывать энергосберегающие технические решения для реализации технологии культивирования насекомого в промышленных масштабах.
Цель исследований – разработка установки для реализации энергосберегающей световой технологии культивирования личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L) в промышленных масштабах.
Для ее достижения решали следующие задачи:
разработать конструкцию универсального модульного биореактора для культивирования личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L) в промышленных масштабах;
определить режимы энергосберегающей световой технологии выращивания большой восковой молью.
Условия, материалы и методы. Эксперименты по изучению возможности управления поведением имаго большой восковой моли путем воздействия разных факторов (температура, относительная влажность, длительность светодиодного излучения разной спектральной плотности) проводили с 2019 г. на пилотной лабораторной установке [30, 31]. В этой установке имаго G.mellonella помещали в центральный резервуар, из которого они могли свободно перемещаться в любой периферийный резервуар с наиболее комфортными абиотическими параметрами (рис. 1). В результате проведенных исследований были установлены оптимальные температурный и влажностный диапазоны микроклимата для выращивания личинок большой восковой моли – соответственно 30…32 °С и 50…60 % [32, 33]
Принимая во внимание полученные результаты, была разработана конструкция универсальной установки для промышленного культивирования насекомых. Затем проведены исследования по определению оптимальных параметров энергосберегающей световой технологии выращивания большой восковой молью на разработанной установке. Эксперименты проводили в лаборатории Удмуртского федерального исследовательского центра Уральского отделения Российской академии наук (УдмФИЦ УрО РАН). Повторность опытов 4-кратная, по 20 особей G.mellonella в каждой. Изучали влияние длины волны излучения светодиодов (400 нм, 491 нм, 546 нм и 577 нм) и продолжительности облучения (10, 30 и 60 мин.) на количество взрослых особей G.mellonella, которые перемещались в модуль для бабочек разработанной установки. Температуру в универсальном биореакторе поддерживали на уровне 28 °С, влажность воздуха – 50 %. Статистическую обработку данных проводили с использованием электронных таблиц Excel: определяли среднее арифметическое значение, ошибку средней, среднее квадратическое отклонение.
Результаты и обсуждение. Разработанная универсальная установка для промышленного культивирования насекомых получила название – модульный биореактор поскольку состоит из двух модулей: первый для бабочек (имаго), второй для личинок, куколок и яиц (рис. 2). Основная функция модуля для личинок и куколок – поддержание комфортных условий для их продуктивного роста до зрелого состояния. Модуль для имаго нужен для их привлечения в отсек для откладки яиц.
Конструктивно модуль для личинок представляет собой параллелепипедообразный короб, имеющий входное и выходное вентиляционные отверстия; систему контроля за параметрами микроклимата; кронштейн для крепления модулей с питательной средой; лоток для сбора продуктов жизнедеятельности и личинок; теплоизоляцию.
Входное и выходное вентиляционные отверстия закрыты сетками, препятствующими миграции личинок и бабочек из садка. Входное отверстие располагается сбоку у основания конструкции, выходное – сверху на крышке садка. Площадь отверстий учитывает скорость движения воздушных потоков, при которой не появляется плесень и различные вредные микроорганизмы.
Контроль параметров микроклимата внутри садка осуществляется в два этапа: сбор показаний состояния и воздействие для обеспечения комфортной среды биологическому объекту. Разработанная система управления автоматически поддерживает параметры микроклимата в указанном диапазоне, нагревая воздушные потоки во входном отверстии при помощи алюминиевого радиатора и термоэлектрического нагревателя. В отношении влажности возможны два варианта контроля: пассивный и активный. Пассивный реализуется с использованием небольшого резервуара с водой у входного вентиляционного отверстия садка, активный – путем ультразвукового распыления влаги. Все необходимые параметры фиксирует микропроцессорная система управления при помощи цифровых датчиков. Они передаются в базу данных, где обрабатываются и сравниваются с заданными. При необходимости изменения параметров абиотических факторов можно воспользоваться соответствующим предварительно разработанным алгоритмом.
Модули с питательным наполнителем имеют внешний вид как у рамки для пчелиных сот (рис. 3) и устанавливаются на специальные кронштейны, удерживающие их в вертикальном положении. В предлагаемой конструкции предусмотрены три ячейки под такие модули.
Внизу модуля для личинок расположен сменный лоток для сбора продуктов жизнедеятельности и личинок, который может быть извлечен из садка в любое время.
Теплоизоляция вокруг садка представляет собой накладные двухсантиметровые полипропиленовые листы. Его каркасные стенки выполнены из листовой стали и покрыты порошковой окраской. Боковые стенки выполнены из синтетического прозрачного стекла для наблюдения за насекомыми.
Конструктивно модуль для бабочек – это металлическая коробка в форме куба со светодиодным излучателем и отсеком откладки яиц (рис. 4). Он устанавливается в верхней части модуля для личинок (см. рис. 2). Выманивание бабочек осуществляется с помощью коротковолнового оптического излучения. Для этого в верхней части модуля для имаго расположена светодиодная планка с источниками излучения в виде энергосберегающих светодиодов, длину волны которых можно варьировать от 400 нм до 577 нм. Внизу модуля для имаго расположен картридж для сбора яиц, на дне которого находится сложенная гармошкой бумага.
Результаты экспериментов по оптимизации параметров разработанной установки указывают на то, что наиболее эффективно оптическое излучение с длиной волны 400 нм. При его использовании в модуль имаго переместились 45 % бабочек (рис. 5), что на 12…35 % выше, чем в других вариантах.
В ходе изучения сроков продолжительности облучения с оптимальной длиной волны (400 нм) установлено, что разница по количеству переместившихся бабочек составляет 1…2 % (рис. 6). Поэтому работу светодиодов рекомендуется поддерживать в течение 10 мин.
Выводы. В результате исследований разработана конструкция универсального модульного биореактора для культивирования личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L) в промышленных масштабах.
При промышленном культивировании большой восковой моли Galleria mellonella) целесообразно использовать светодиоды с длиной волны 400 нм с продолжительностью их работы 10 мин. при температуре воздуха 28 0С и влажности 50 %.
1. A powerful in vivo alternative model in scientific research: Galleria mellonella / P. Singkum, S. Suwanmanee, P. Pumeesat, et al. //Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 2019. Vol. 66. No. 1, P. 31-55. doi:https://doi.org/10.1556/030.66.2019.001
2. Клочко Р.Т., Луганский С.Н., Котова А.А. Большая восковая моль // Пчеловодство. 2012. №2. С. 24-26.
3. Осокина А.С., Колбина Л.М., Гущин А.В. Биологические основы разведения большой восковой моли (Galleria mellonella L.) как источника биологически активных веществ. Ижевск: Издательство Анны Зелениной, 2019. 166 с.
4. Осокина А.С., Колбина Л.М. Биологические особенности развития вредителя Galleria mellonella в естественных условиях // Биомика. 2019. Т. 11. № 2. С. 135-142.
5. Gulati R., Kaushik H. Enemies of honeybees and their management - A review // Agric. Rev. 2004. Vol. 25. P. 189-200.
6. Arvanitis M., Glavis-Bloom J., Mylonakis E. Invertebrate models of fungal infection // Biochim Biophys Acta. 2013. Vol. 1832. P. 1378-1383.
7. Diet influences the bacterial and free fatty acid profiles of the culicle of Galleria mellonella larvae / M. Kazek, A. Kaczmarek, A.K. Wronsks, et al. // PLoS ONE. 2019. Vol. 14. No. 2. e0211697. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6366757/pdf/pone.0211697.pdf (дата обращения 20.05.2021). doi: 10/1371/journal.pone.0211697.
8. Искусственный корм для большой вощинной пчелиной огневки: пат. СССР № 3662964/30-15 МПК: A01K67 / Шагов Е.М., Уланова Г.И., Асланян Е.М.; заявитель и патентообладатель: Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии. № 3662964/30-15; заявл.: 11.11.83 опубл.: 23.05.1986, Бюл. №. 19. 3 с.
9. Особенности Apis mellifera L., Galleria mellonella L. Производство и комплексное использование биологически активных продуктов: монография / М. К. Чугреев, М. М. Борисова, Л. С. Дроздова и др. М.: РГАУ-МСХА, 2014. 200 с.
10. Bednařova M., Borkovcova M, Fišer V. Zakladninutrični profil larev zaviječe voskoveho (Galleria mellonella) // Mendelnet. 2012. Vol. 1. P. 722-727.
11. Злотин А.З. Техническая энтомология: справочное пособие. Киев: Наукова думка, 1989. 183 с.
12. Marston N., Campbell B. Comparison of nine diets for rearing Galleria mellonella // Annals of the Entomological society of America. 1973. Vol. 66. No 1. P. 132-136.
13. Eischen F. A., Dietz A. E. Improved culture techniques for mass rearing Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) // Ent. News. 1990. Vol. 101. No. 2. P. 123-128.
14. Ashfad N., Sohail A. Al-Temenu M. Effect of artificial diets on some parameters of greater wax moth, Galleria mellonella L. under optimum conditions // J. Agric. Res. 2005. Vol. 43. No. 3. P. 223-228.
15. Bronskill J.F. A cage to simplify the rearing of the greater wax moth, Galleria mellonella (Pyralidae) // Journal of the Lepidopterists Society. 1961. Vol. 15. No. 2. P. 102-104.
16. Способ получения биологически активного продукта из личинок большой восковой моли: пат. RU 2038086 Рос. Федерация / Спиридонов Н.А., Рачков А.К., Мухин С.А. и др.; заявитель Институт теоретической и экспериментальной биофизики АН СССР, патентообладатель Спиридонов Н.А. - № 4938002/14; заявл. 26.03.1991;опубл. 27.06.1995, Бюл. №18 - 9 с.: ил.
17. Rearing and Maintenance of Galleria mellonella and Its Application to Study Fungal Virulence / C. Firacative, A. Khan, S. Duan, et al. // J Fungi (Basel). 2020.Vol. 6. No. 3. P. 130. doi:https://doi.org/10.3390/jof6030130.
18. Pereira M. F., Rossi C. C. Overview of rearing and testing conditions and a guide for optimizing Galleria mellonella breeding and use in the laboratory for scientific purposes // APMIS. 2020. Vol. 128. No. 12. P. 607-620. doi:https://doi.org/10.1111/apm.13082.
19. addock F.B. The beewoth or waxworm // Texas Agricultural Experiment Station Bulletin. 1918. No. 231. 38 p.
20. Hosamani V., Swamy B.C., Kattimani K.N., Kalibavi C.M. Studies on Biology of Greater Wax Moth (Galleria mellonella L.) // International Journal of Current Microbiological and Applied Science. 2017. № 6(11). P. 3811-3815 https://doi.org/10.20546/ijcmas.2017.611.4474
21. Мишин И.Н. Корм (питающий субстрат) для выращивания личинок большой восковой моли. Патент № 2017146529 от 27.12.2017 .С.5
22. Shagov E.M., Ulanova G.I., Aslanyan E.M. Artificial food for the large wax bee moth // Patent SSSR № 3662964/30-15. 1986. Byul. №. 19.
23. Coskun M., Kayis T., Sulanc M., Ozalp P.Effect of different honeycomb and sucrose on the development of the greater wax moth Galleria mellonella L. larvae // International journal of agricultural and biology. 2006. Vol. 8. No. 6. P. 855-858.
24. Haydak M. Is wax a necessary constituent of the diet of wax moth larvae? // Annals entomological of society of America. 1936. Vol. XXIX. P. 581-588.
25. Перспектива производственного получения биосырья из насекомых на примере личинок G.mellonella / В.В. Соколов, А. С. Осокина, В. В. Касаткин и др. // Аграрное образование и наука в развитии животноводства: материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию заслуженного работника сельского хозяйства РФ, почетного работника ВПО РФ, лауреата государственной премии УР, ректора ФГБОУ ВО Ижевская ГСХА, доктора сельскохозяйственных наук, профессора Любимова Александра Ивановича. 2020. Т. 2. С. 204-208
26. Осокина А.С., Платунова Г.Р. Возможность биодеструкции синтетических полимеров с использованием личинок Galleria mellonella L // Утилизация отходов производства и потребления: инновационные подходы и технологии: материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Киров: Вятский государственный университет; Институт биологии Коми научного центра УРО РАН; ФГУП «РосРАО». 2019. С. 162-167.
27. Большин Р.Г., Кондратьева Н.П., Краснолуцкая М.Г. Разработка цифровых автоматизированных систем для управления поведением живых объектов. Тенденции развития науки и образования. 2020. № 65-1. С. 126-129. doihttps://doi.org/10.18411/lj-09-2020-28.
28. Цифровые электротехнологии для управления поведением насекомых / Н. П. Кондратьева, Д. В. Бузмаков, И. Р. Ильясов и др. // Электротехнологии и электрооборудование в АПК. 2020. Т. 67. № 3 (40). С. 9-16. doi:https://doi.org/10.22314/2658-4859-2020-67-3-9-16.
29. Цифровые световые технологии для управления поведением Galleria Mellonella / Н. П. Кондратьева, Д. В. Бузмаков, И. Р. Ильясов и др. // Сельскохозяйственные машины и технологии. 2021. Т. 15. № 1. С. 78-83. doi:https://doi.org/10.22314/2073-7599-2021-15-1-78-83.
30. Effect of optical radiation on greater wax moth (Galleria mellonella L.) - pest of bee colonies / N. P. Kondrateva, D. V. Buzmakov, R. G. Bolshin, et al. // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. International AgroScience Conference. 2020. No. 433. С.012036. URL:hptt://www.researchgate.net/publication/339246287_Effect_of_optical_radiation_on_greater_wax_moth_Galleria_mellonella_L_- pest_of_bee_colonies (дата обращения 26.06.2021). doi:https://doi.org/10.1088/1755-1315/433/1/012036.
31. Результаты опытов по применению световых энергосберегающих электротехнологий для отлова насекомых / Н. П. Кондратьева, Д. В. Бузмаков, Р. Г. Большин и др. // Вестник НГИЭИ. 2019. № 12 (103). С. 25-36.
32. Управление поведением живых существ с помощью цифровых технологий / Н. П. Кондратьева, Д. В. Бузмаков, И. Р. Ильясов, et al. // Евразийское Научное Объединение. 2020. № 8-2 (66). С. 107-110. doi:https://doi.org/10.5281/zenodo.4023138.
33. Pereira MF, Rossi CC. Overview of rearing and testing conditions and a guide for optimizing Galleria mellonella breeding and use in the laboratory for scientific purposes. APMIS. 2020; Vol. 128. 12. 607-620 p. doi:https://doi.org/10.1111/apm.13082.
