Izhevsk, Russian Federation
Russian Federation
Russian Federation
Russian Federation
UDK 62 Инженерное дело. Техника в целом. Транспорт
UDK 63 Сельское хозяйство. Лесное хозяйство. Охота. Рыбное хозяйство
GRNTI 68.85 Механизация и электрификация сельского хозяйства
The larvae of the greater wax moth (Galleria mellonella L.) are not only a serious pest of bee colonies, but also a valuable raw material for the production of biologically active substances widely used in pharmaceuticals, cosmetology, food industry, animal feed, as well as a source of high-quality protein. We have developed an energy-saving installation for industrial insect cultivation, consisting of two modules: the first for butterflies (adults), the second for larvae, pupae and eggs. To implement energy-saving light technology, experiments with a large wax moth were carried out in the laboratory of Udmurt Federal Research Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences. The experiments were repeated 4 times. There were 20 specimens of G. mellonella in each experiment. The air temperature was maintained at 28° C, air humidity 50%. The influence of the duration and wavelength of radiation (400 nm, 491 nm, 546 nm and 577 nm) on the number of adults that moved to the module for butterflies and on the mass of laid eggs was studied. The radiation of 400 nm turned out to be the most effective, since 45% of butterflies moved to it and the mass of laid eggs was 32%, which is significantly higher than that of the radiation of 491, 546 and 577 nm. The duration of the radiation was 10 minutes, 30 minutes and 60 min. With an experiment duration of 60 min. 45% of the large wax moth is transferred to the butterfly module, with an experiment duration of 30 minutes. - 44%, and with an experiment duration of 10 minutes, 43% of the large wax moth moved. Therefore, it is recommended to maintain the operating time of LEDs with a wavelength of 400 nm for 30 minutes. The aim of the research is to develop an installation for the implementation of energy-saving light technology for the cultivation of larvae of the greater wax moth (Galleria mellonella L.) on an industrial scale
greater wax moth (Galleria mellonella L.), universal energy-saving modular bioreactor, energy saving lighting technologies
Введение. Для решения общебиологических вопросов проводят научные исследования in vivo с использованием широкого спектра модельных организмов. Отдельный интерес представляют насекомые. В частности, при изучении вирулентности и патогенеза грибов широко используют личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L.) [1]. Насекомые этого вида эволюционно приспособлены к жизни в ульях совместно с пчелиными семьями и считаются серьезными вредителями. Цикл развития G. mellonella включает следующие стадии: яйцо, личинка (гусеница), куколка (хризалида), взрослая особь (имаго) [2]. За период жизнедеятельности самки откладывают в среднем 760,9±168,88 яиц, или 161,80±45,87 яиц в день [5].
Простота размножения G. mellonella, многочисленное потомство, короткий цикл развития, известный геном и связанный с иммунитетом транскриптом делает из этого насекомого удобную исследовательскую модель для изучения иммунитета на биохимическом и молекулярном уровнях. У большой восковой моли он состоит только из врожденных механизмов и проявляет адаптивную пластичность, которая в последние годы стала предметом интенсивных научных исследований. Это насекомое служит мини-хозяином в исследованиях патогенности микроорганизмов и in vivo тестах эффективности отдельных факторов вирулентности и новых антимикробных соединений [6].
Для таких исследований личинок выращивают в лабораториях с использованием искусственных кормов и содержат в различных условиях. Вариация этих абиотических факторов может повлиять на восприимчивость модельного объекта к исследуемым веществам. Поэтому существует острая необходимость в стандартизации процедур и условий культивирования G. mellonella с целью получения качественных, не подверженных стрессу личинок с наименьшей генетической изменчивостью.
Помимо лабораторных целей личинки G. mellonella служат сырьём для производства биологически активных веществ многоцелевого назначения (фармацевтика, косметология, пищевая промышленность, стимулирующие добавки к кормам для животных) [7, 8, 9].
В последние годы насекомых все шире используют как источник высококачественного протеина [10, 11]. В этом случае необходимо культивировать большие объемы стандартизированного биоматериала, что требует отлаженной производственной цепочки. Решением таких задач занимается техническая энтомология, которая активно развивалось в СССР в конце 80-х годов [11, 12].
Технология выращивания личинок для небольших лабораторных исследований предусматривает содержание насекомых в сосудах из экологически безопасного материала (стекло, дерево, пластик), снабженных крышкой с вентиляционным отверстием, затянутым мелкоячеистой металлической сеткой [13, 14]. Объем сосуда зависит от необходимого количества личинок. По литературным данным он может составлять 0,5…8,0 л [15, 16]. Joan F. Bronskill в 1961 г. разработал специальный стеклянный сосуд для содержания личинок с двойным ячеистым дном [17]. Исследователи во главе с Н.А. Спиридоновым выращивали личинок в чашках Петри и стеклянных банках, снабженных крышками с мелкоячеистой впаянной сеткой при 20…25 °С и относительной влажности 60 % [18]. При этом на внутренней боковой поверхности модифицированной чашки Петри был расположен кольцевой выступ под углом по направлению к ее основанию, что позволяло визуально контролировать личинок, пополнять питательную среду без возможности выхода личинок и полностью устранять их травматизм [19].
При разработке устройства для культивирования насекомых в лабораторных условиях важно знать их жизненный цикл и учитывать особенности развития. Известно, что в лабораторных условиях личинок выращивают 5…6 недель, добавляя два раза в неделю свежую питательную среду [20, 21]. Разделение в новые банки обеспечивает необходимые условия питания и предотвращает переполнение, которое может вызвать стресс и обесцвечивание личиночных кутикул. Старую среду регулярно выбрасывают. Крышки очищают от паутины и окукливающихся личинок для того, чтобы улучшить перекрестную вентиляцию. Процесс окукливания G. mellonella проходит в течение 2…3 недель, после чего появляются имаго [20, 21]. На протяжении этого времени необходимо создавать благоприятные для существования насекомых условия.
Важный фактор развития и жизнедеятельности любого насекомого – питательная среда. Часть исследователей кормят личинок восковой моли естественной пищей – пчелиной сушью (выбракованные соты) или мервой (перетопленные соты) [22, 23]. К недостаткам такого субстрата относится повышенная влажность, которая влечёт за собой плесневение. Кроме того, он не сбалансирован по питательным веществам, что важно при постановке экспериментов. Поэтому разработано более 20 искусственных питательных сред для культивирования личинок G.mellonella [24, 25]. Известен ряд питательные сред зарубежных ученых [26] преимущества которых заключаются в простоте приготовления, балансе белков, жиров и углеводов.
Обеспечение необходимых параметров в лабораторных и промышленных условиях возможно посредством использования микропроцессорных систем управления для контроля температурного режима, относительной влажности воздуха, состояния и состава кормового субстрата [27, 28, 29]. На этой основе можно разрабатывать энергосберегающие технические решения для реализации технологии культивирования насекомого в промышленных масштабах.
Цель исследований – разработка установки для реализации энергосберегающей световой технологии культивирования личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L) в промышленных масштабах.
Для ее достижения решали следующие задачи:
разработать конструкцию универсального модульного биореактора для культивирования личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L) в промышленных масштабах;
определить режимы энергосберегающей световой технологии выращивания большой восковой молью.
Условия, материалы и методы. Эксперименты по изучению возможности управления поведением имаго большой восковой моли путем воздействия разных факторов (температура, относительная влажность, длительность светодиодного излучения разной спектральной плотности) проводили с 2019 г. на пилотной лабораторной установке [30, 31]. В этой установке имаго G.mellonella помещали в центральный резервуар, из которого они могли свободно перемещаться в любой периферийный резервуар с наиболее комфортными абиотическими параметрами (рис. 1). В результате проведенных исследований были установлены оптимальные температурный и влажностный диапазоны микроклимата для выращивания личинок большой восковой моли – соответственно 30…32 °С и 50…60 % [32, 33]
Принимая во внимание полученные результаты, была разработана конструкция универсальной установки для промышленного культивирования насекомых. Затем проведены исследования по определению оптимальных параметров энергосберегающей световой технологии выращивания большой восковой молью на разработанной установке. Эксперименты проводили в лаборатории Удмуртского федерального исследовательского центра Уральского отделения Российской академии наук (УдмФИЦ УрО РАН). Повторность опытов 4-кратная, по 20 особей G.mellonella в каждой. Изучали влияние длины волны излучения светодиодов (400 нм, 491 нм, 546 нм и 577 нм) и продолжительности облучения (10, 30 и 60 мин.) на количество взрослых особей G.mellonella, которые перемещались в модуль для бабочек разработанной установки. Температуру в универсальном биореакторе поддерживали на уровне 28 °С, влажность воздуха – 50 %. Статистическую обработку данных проводили с использованием электронных таблиц Excel: определяли среднее арифметическое значение, ошибку средней, среднее квадратическое отклонение.
Результаты и обсуждение. Разработанная универсальная установка для промышленного культивирования насекомых получила название – модульный биореактор поскольку состоит из двух модулей: первый для бабочек (имаго), второй для личинок, куколок и яиц (рис. 2). Основная функция модуля для личинок и куколок – поддержание комфортных условий для их продуктивного роста до зрелого состояния. Модуль для имаго нужен для их привлечения в отсек для откладки яиц.
Конструктивно модуль для личинок представляет собой параллелепипедообразный короб, имеющий входное и выходное вентиляционные отверстия; систему контроля за параметрами микроклимата; кронштейн для крепления модулей с питательной средой; лоток для сбора продуктов жизнедеятельности и личинок; теплоизоляцию.
Входное и выходное вентиляционные отверстия закрыты сетками, препятствующими миграции личинок и бабочек из садка. Входное отверстие располагается сбоку у основания конструкции, выходное – сверху на крышке садка. Площадь отверстий учитывает скорость движения воздушных потоков, при которой не появляется плесень и различные вредные микроорганизмы.
Контроль параметров микроклимата внутри садка осуществляется в два этапа: сбор показаний состояния и воздействие для обеспечения комфортной среды биологическому объекту. Разработанная система управления автоматически поддерживает параметры микроклимата в указанном диапазоне, нагревая воздушные потоки во входном отверстии при помощи алюминиевого радиатора и термоэлектрического нагревателя. В отношении влажности возможны два варианта контроля: пассивный и активный. Пассивный реализуется с использованием небольшого резервуара с водой у входного вентиляционного отверстия садка, активный – путем ультразвукового распыления влаги. Все необходимые параметры фиксирует микропроцессорная система управления при помощи цифровых датчиков. Они передаются в базу данных, где обрабатываются и сравниваются с заданными. При необходимости изменения параметров абиотических факторов можно воспользоваться соответствующим предварительно разработанным алгоритмом.
Модули с питательным наполнителем имеют внешний вид как у рамки для пчелиных сот (рис. 3) и устанавливаются на специальные кронштейны, удерживающие их в вертикальном положении. В предлагаемой конструкции предусмотрены три ячейки под такие модули.
Внизу модуля для личинок расположен сменный лоток для сбора продуктов жизнедеятельности и личинок, который может быть извлечен из садка в любое время.
Теплоизоляция вокруг садка представляет собой накладные двухсантиметровые полипропиленовые листы. Его каркасные стенки выполнены из листовой стали и покрыты порошковой окраской. Боковые стенки выполнены из синтетического прозрачного стекла для наблюдения за насекомыми.
Конструктивно модуль для бабочек – это металлическая коробка в форме куба со светодиодным излучателем и отсеком откладки яиц (рис. 4). Он устанавливается в верхней части модуля для личинок (см. рис. 2). Выманивание бабочек осуществляется с помощью коротковолнового оптического излучения. Для этого в верхней части модуля для имаго расположена светодиодная планка с источниками излучения в виде энергосберегающих светодиодов, длину волны которых можно варьировать от 400 нм до 577 нм. Внизу модуля для имаго расположен картридж для сбора яиц, на дне которого находится сложенная гармошкой бумага.
Результаты экспериментов по оптимизации параметров разработанной установки указывают на то, что наиболее эффективно оптическое излучение с длиной волны 400 нм. При его использовании в модуль имаго переместились 45 % бабочек (рис. 5), что на 12…35 % выше, чем в других вариантах.
В ходе изучения сроков продолжительности облучения с оптимальной длиной волны (400 нм) установлено, что разница по количеству переместившихся бабочек составляет 1…2 % (рис. 6). Поэтому работу светодиодов рекомендуется поддерживать в течение 10 мин.
Выводы. В результате исследований разработана конструкция универсального модульного биореактора для культивирования личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L) в промышленных масштабах.
При промышленном культивировании большой восковой моли Galleria mellonella) целесообразно использовать светодиоды с длиной волны 400 нм с продолжительностью их работы 10 мин. при температуре воздуха 28 0С и влажности 50 %.
1. Singkum P, Suwanmanee S, Pumeesat P. [A powerful in vivo alternative model in scientific research: Galleria mellonella]. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 2019; Vol. 66. 1. 31-55 p. doi:https://doi.org/10.1556/030.66.2019.001
2. Klochko RT, Luganskii SN, Kotova AA. [Large wax moth]. Pchelovodstvo. 2012; 2. 24-26 p.
3. Osokina AS, Kolbina LM, Gushchin AV. Biologicheskie osnovy razvedeniya bol'shoi voskovoi moli (Galleria mellonella L.) kak istochnika biologicheski aktivnykh veshchestv. [The biological basis for the cultivation of the large wax moth (Galleria mellonella L.) as a source of biologically active substances]. Izhevsk: Izdatel'stvo Anny Zeleninoi. 2019; 166 p.
4. Osokina AS, Kolbina LM. [Biological features of the development of the pest Galleria mellonella in natural conditions]. Biomika. 2019; Vol. 11. 2. 135-142 p.
5. Gulati R, Kaushik H. Enemies of honeybees and their management - a review. Agric. Rev. 2004; Vol. 25. 189-200 p.
6. Arvanitis M, Glavis-Bloom J, Mylonakis E. Invertebrate models of fungal infection. Biochim Biophys Acta. 2013; Vol. 1832. 1378-1383 p.
7. Kazek M, Kaczmarek A, Wronsks AK. Diet influences the bacterial and free fatty acid profiles of the culicle of Galleria mellonella larvae. [Internet]. PLoS ONE. 2019; Vol. 14. 2. e0211697. [cited 2021, May 20]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6366757/pdf/pone.0211697.pdf (data obrashcheniya 20.05.2021). doi: 10/1371/journal.pone.0211697.
8. Shagov EM, Ulanova GI, Aslanyan EM. Iskusstvennyi korm dlya bol'shoi voshchinnoi pchelinoi ognevki: pat. SSSR № 3662964/30-15 MPK: A01K67. [Artificial food for the big wax bee moth]. Zayavitel' i patentoobladatel': Vsesoyuznyi nauchno-issledovatel'skii institut prikladnoi mikrobiologii. № 3662964/30-15; zayavl.: 11.11.1983 opubl.: 23.05.1986, Byul. №. 19. 3 p.
9. Chugreev MK, Borisova MM, Drozdova LS. Osobennosti Apis mellifera L., Galleria mellonella L. Proizvodstvo i kompleksnoe ispol'zovanie biologicheski aktivnykh produktov: monografiya. [Peculiarities of Apis mellifera L., Galleria mellonella L. Production and integrated use of biologically active products: monograph]. Moscow: RGAU-MSKhA. 2014; 200 p.
10. Bednařova M, Borkovcova M, Fišer V. Zakladninutrični profil larev zaviječe voskoveho (Galleria mellonella) // Mendelnet. 2012; Vol. 1. 722-727 p. Czech.
11. Zlotin AZ. Tekhnicheskaya entomologiya: spravochnoe posobie. [Technical entomology: a reference manual]. Kiev: Naukova dumka. 1989; 183 p.
12. Marston N, Campbell B. Comparison of nine diets for rearing Galleria mellonella. Annals of the Entomological society of America. 1973; Vol. 66. 1. 132-136 p.
13. Eischen FA, Dietz AE. Improved culture techniques for mass rearing Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Ent. News. 1990; Vol. 101. 2. 123-128 p.
14. Ashfad N, Sohail A, Al-Temenu M. Effect of artificial diets on some parameters of greater wax moth, Galleria mellonella L. under optimum conditions. J.Agric. Res. 2005; Vol. 43. 3. 223-228 p.
15. Bronskill JF. A cage to simplify the rearing of the greater wax moth, Galleria mellonella (Pyralidae). Journal of the Lepidopterists society. 1961; Vol. 15. 2. 102-104 p.
16. Spiridonov NA, Rachkov AK, Mukhin SA. Sposob polucheniya biologicheski aktivnogo produkta iz lichinok bol'shoi voskovoi moli: pat. RU 2038086 Ros. Federatsiya. [A method of obtaining a biologically active product from the larvae of a large wax moth]. Zayavitel': Institut teoreticheskoi i eksperimental'noi biofiziki AN SSSR, patentoobladatel' Spiridonov N.A. - № 4938002/14; zayavl. 26.03.1991; opubl. 27.06.1995, Byul. №18 - 9 p.: ill.
17. Firacative C, Khan A, Duan S. Rearing and maintenance of Galleria mellonella and its application to study fungal virulence. J Fungi (Basel). 2020; Vol. 6. 3. 130 p. doi:https://doi.org/10.3390/jof6030130.
18. Pereira M. F., Rossi C. C. Overview of rearing and testing conditions and a guide for optimizing Galleria mellonella breeding and use in the laboratory for scientific purposes // APMIS. 2020. Vol. 128. No. 12. P. 607-620. doi:https://doi.org/10.1111/apm.13082.
19. Paddock FB. The beewoth or waxworm. Texas Agricultural Experiment Station Bulletin. 1918; 231. 38 p.
20. Hosamani V, Swamy BC, Kattimani KN, Kalibavi CM. Studies on Biology of Greater Wax Moth (Galleria mellonella L.). International Journal of current Microbiological and Applied Science. 2017; 6 (11). 3811-3815 p. https://doi.org/10.20546/ijcmas.2017.611.4474
21. Mishin IN. Korm (pitayushchii substrat) dlya vyrashchivaniya lichinok bol'shoi voskovoi moli. [Food (feeding substrate) for growing the larvae of the large wax moth]. Patent № 2017146529 ot 27.12.2017. 5 p.
22. Shagov EM, Ulanova GI, Aslanyan EM. Artificial food for the large wax bee moth. Patent SSSR № 3662964/30-15. 1986. Byul. №. 19.
23. Coskun M, Kayis T, Sulanc M, Ozalp P. Effect of different honeycomb and sucrose on the development of the greater wax moth Galleria mellonella L. larvae. International journal of agricultural and biology. 2006; Vol. 8. 6. 855-858 p.
24. Haydak M. Is wax a necessary constituent of the diet of wax moth larvae? Annals entomological of society of America. 1936; Vol. XXIX. 581-588 p.
25. Sokolov VV, Osokina AS, Kasatkin VV. Perspektiva proizvodstvennogo polucheniya biosyr'ya iz nasekomykh na primere lichinok G.mellonella. Agrarnoe obrazovanie i nauka v razvitii zhivotnovodstva: materialy Mezhdunarodnoi nauchno-prakticheskoi konferentsii. [Prospects for the production of biological raw materials from insects on the example of G.mellonella larvae. Agrarian education and science in the development of animal husbandry: proceedings of the International scientific and practical conference]. 2020; Vol. 2. 204-208 p.
26. Osokina AS, Platunova GR. Vozmozhnost' biodestruktsii sinteticheskikh polimerov s ispol'zovaniem lichinok Galleria mellonella L. Utilizatsiya otkhodov proizvodstva i potrebleniya: innovatsionnye podkhody i tekhnologii: materialy Vserossiiskoi nauchno-prakticheskoi konferentsii. [Possibility of biodegradation of synthetic polymers using larvae of Galleria mellonella L. Utilization of production and consumption waste: innovative approaches and technologies: proceedings of All-Russian scientific and practical conference with international participation]. Kirov: Vyatskii gosudarstvennyi universitet; Institut biologii Komi nauchnogo tsentra URO RAN; FGUP ‘RosRAO”. 2019; 162-167 p.
27. Bol'shin RG, Kondrat'eva NP, Krasnolutskaya MG. Razrabotka tsifrovykh avtomatizirovannykh sistem dlya upravleniya povedeniem zhivykh ob"ektov. Tendentsii razvitiya nauki i obrazovaniya. [Development of digital automated systems to control the behavior of living objects. Trends in the development of science and education]. 2020; 65-1. 126-129 p. doihttps://doi.org/10.18411/lj-09-2020-28.
28. Kondrat'eva NP, Buzmakov DV, Il'yasov IR. [Digital electrical technologies for controlling insect behavior]. Elektrotekhnologii i elektrooborudovanie v APK. 2020; Vol. 67. 3 (40). 9-16 p. doi:https://doi.org/10.22314/2658-4859-2020-67-3-9-16.
29. Kondrat'eva NP, Buzmakov DV, Il'yasov IR. [Digital light technologies for controlling the behavior of Galleria Mellonella L.]. Sel'skokhozyaistvennye mashiny i tekhnologii. 2021; Vol. 15. 1. 78-83 p. doi:https://doi.org/10.22314/2073-7599-2021-15-1-78-83.
30. Kondrateva NP, Buzmakov DV, Bolshin RG. [Effect of optical radiation on greater wax moth (Galleria mellonella L.) - pest of bee colonies. [Internet]. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. International AgroScience Conference. 2020; 433. 012036 p. [cited 2020, February 24]. Available from:hptt://www.researchgate.net/publication/339246287_Effect_of_optical_radiation_on_greater_wax_moth_Galleria_mellonella_L_- pest_of_bee_colonies (data obrashcheniya 26.06.2021). doi:https://doi.org/10.1088/1755-1315/433/1/012036.
31. Kondrat'eva NP, Buzmakov DV, Bol'shin RG. [The results of experiments on the use of light energy-saving electrical technologies for trapping insects]. Vestnik NGIEI. 2019; 12 (103). 25-36 p.
32. Kondrat'eva NP, Buzmakov DV, Il'yasov IR. [Management of the behavior of living beings using digital technologies]. Evraziiskoe nauchnoe ob"edinenie. 2020; 8-2 (66). 107-110 p. doi:https://doi.org/10.5281/zenodo.4023138.
33. Pereira MF, Rossi CC. Overview of rearing and testing conditions and a guide for optimizing Galleria mellonella breeding and use in the laboratory for scientific purposes. APMIS. 2020; Vol. 128. 12. 607-620 p. doi:https://doi.org/10.1111/apm.13082.
