В современных условиях сельского хозяйства происходит увеличение использования различных микроорганизмов в качестве основы биологических удобрений и средств биологической защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов [1, 2, 3]. Кроме того, такие биопрепараты стимулируют рост культурных растений и обеспечивают увеличение стрессоустойчивости к биотическим и абиотическим стрессорам [4]. Новыми источниками для формирования биопрепаратов могут послужить микроорганизмы (эндофиты, эпифиты), полученные из дикорастущих растений [5]. Бактерии, обитающие в неокультуренных (диких) растениях (эндофиты и эпифиты), играют важную роль в их экосистеме. Некоторые из них способствуют фиксации азота [6]. Кроме того, из-за сильной конкуренции в дикой среде, эндофитные бактерии растений могут противостоять фитопатогенным грибам и бактериям [7, 8]. Благодаря сложившимся микробиоценозам, дикорастущие виды меньше подвержены болезням. В то же время, наряду с полезными бактериями в диких растениях существуют и фитопатогенные микроорганизмы, вызывающие такие заболевания, как мокрые гнили, ожоги, пятнистости и др. [9]. В целом, бактерии, диких растений, как эндофитные, так и эпифитные, играют важную роль в поддержании экологического баланса, который сложился благодаря многовековой естественной селекции, и могут быть использованы в таких областях, как очистка сточных вод, биоремедиация и сельское хозяйство.
Таким образом, бактерии, ассоциированные с дикорастущими растениями, представляют большой интерес для понимания микробно-растительных взаимодействий и практического применения в сельском хозяйстве.
Цель исследования – создать новые консорциумы из микроорганизмов, полученных из дикорастущих видов растений и проверить возможность их поддержания в почве и ризосфере.
Условия, материалы и методы. В качестве новых источников бактериальных изолятов были использованы растения зверобоя (Hypericum perforatum), душицы (Origanum vulgare), подорожника (Plantago major) и камыша (Scirpus sylvaticus). Образцы почв и растений, использованные для эксперимента, были отобраны в период с марта по июнь 2023 г садово-дачное товарищество Волга, Казань, Республика Татарстан 55.822079 широты, 48.839731 долготы. Каждая проба была отобрана в трех проворностях.
Все образцы почвы и дикорастущих растений (корни и надземные части), собирали в стерильные пробирки на 50 мл и доставляли в лабораторию. Бактериальные изоляты получали из проб растений и почвы методом смыва (к испытуемому образцу приливали фосфатно-солевой буфер (ФСБ) в соотношении 1:9, перемешивали с помощью вортекса в течение 1 минуты). Полученные смывы через серию разведений поверхностно высевали на неселективную среду Кing В (пептон – 10 г/л, глицерин – 10 г/л, агар микробиологический – 18 г/л, сульфат магния – 12,5 мМ, фосфат калия двузамещенный – 8,6 мМ) с антигрибковым препаратом нистатином в концентрации 32 мкг/мл. Засеянные чашки Петри инкубировали при температуре +30 °С в течении суток. Затем из чашек с бактериями отбирали все отдельные колонии для понимания видового соотношения микробиома исследуемого образца. После получения необходимой биомассы бактерий, бактериальные колонии ресуспендировали в ФСБ, добавляли глицерин в соотношении 0,7:0,3=образец:глицерин и убирали на криохранение. Далее определяли ферментативные активности полученных изолятов.
Для определения протеолитической активности, бактериальные штаммы высевали на чашку Петри с базовой средой (BM) с добавлением молочного белка казеина, содержащей на 1 л 5,8 г фосфата калия двузамещенного, 3 г фосфата калия однозамещенного, 1 г сульфата аммония, 1,5 г сульфата магния семиводного, 10 г сухого обезжиренного молока, 15 г агара и культивировали в суховоздушном термостате ТС-1/20 СПУ (Амедис Инжиниринг, РФ). Вокруг колоний бактериальных изолятов, обладающих протеолитической активностью, наблюдали зоны просветления, образуемые в результате гидролиза казеина в среде [10].
При определения фитазной активности, штаммы высевали на чашку Петри со средой PSM (phytase screening medium), содержащий на 1 л 20 г глюкозы; 5 г фитата натрия; 5 г нитрата аммония; 0,5 г сульфата магния семиводного; 0,5 г хлорида калия; 0,01 г сульфата железа семиводный; 1 г сульфата марганца четырехводного; 18 г бактериологического агара (размер частиц, сито 60, % не менее 95); 2 г хлорида кальция; рН 7. Штаммы культивировали в суховоздушном термостате ТС-1/20 СПУ (Амедис Инжиниринг, РФ). Штаммы, проявляющие активность, образовывали зону просветления вокруг колоний [11].
Для определения целлюлолитической активности, штаммы высаживали на модифцированную среду ВМ, содержащий на 1 л 5,8 г фосфата калия двузамещенного; 3 г фосфата калия однозамещенного, 1 г сульфата аммония; 1,5 г сульфата магния семиводного; 1 г триптона; 10 г карбоксиметилцеллюлозы; 18 г агара. Штаммы культивировали в суховоздушном термостате ТС-1/20 СПУ (Амедис Инжиниринг, РФ). Целлюлолитическую активность идентифицировали методом детекции зон просветления (желтого цвета) вокруг колонии после окрашивания конго красным, образующихся в связи с разрушением целлюлозы и, тем самым ее комплексов с красителем [12].
Для определения амилазной активности использованили среду следующего состава на 1 л дистиллированной воды: 0,5 г пептона; 0,1 г хлорида калия; 0,5 г сульфата магния семиводного; 0,1 г сульфата аммония; 20 г крахмала; 16 г агар. Штаммы культивировали в суховоздушном термостате ТС-1/20 СПУ (Амедис Инжиниринг, РФ). Гидролиз крахмала в среде детектировали по образованию зон просветления при окраске среды раствором Люголя [13].
Для определения наличия внеклеточных липаз полученные штаммы высевали на среду с добавлением Tween 80, содержащий на 1 л 10 г пептона; 5 г хлорида натрия; 1 г хлорида кальция двуводного; 20 г агара; 10 г Twin 80. Штаммы культивировали в суховоздушном термостате ТС-1/20 СПУ (Амедис Инжиниринг, РФ). Наличие у бактерий внеклеточной липазной активности детектировали по наличию вокруг колоний непрозрачной зоны кальциевых солей жирных кислот, освобожденных из Tween 80 [14].
Для идентификации изолятов бактерий, способных к фиксации азота в аэробных условиях, штаммы высевали в чашки Петри на среду Йенсена (сахароза – 20 г/л, фосфат калия двузамещенный – 1 г/л, сульфат магния – 0,5 г/л, хлорид натрия – 0,5 г/л, сульфат железа – 0,1 г/л, молибдат натрия – 0,005 г/л, карбонат кальция – 2 г/л, агар – 15 г/л) и инкубировали в течение 2-5 суток при 30°С [15].
Изоляты, полученные из дикорастущих растений, идентификации на основании сравнения последовательностей гена 16S pPНК. Для этого геномную ДНК бактерий выделяли стандартным методом. Далее проводили амплификацию фрагмента гена 16S рРНК c использованием стандартных праймеров 27F (5’-gagtttgatcctggctcag-3’) и 1492R (5’-taccttgttacgactt-3’). Полученные ПЦР продукты очищали из агарозного геля с использованием коммерческого набора Gel Extraction Kit (Thermo Scientific) и проводили секвенирование по Сэнгеру (секвенирование проводили в компании «Евроген») [16].
Антагонистическую активность выделенных штаммов определяли против фитопатогенного гриба F. oxysporum. В чашку Петри со средой PDA (картофельный бульон – 1 л, декстроза – 20 г/л, агар – 20 г/л) в равноудаленном расстоянии друг от друга вносили 3 мкл суспензии штаммов бактерий и 2 мкл суспензии фитопатогенного гриба в шахматном порядке и выдерживали в течение 5 суток при температуре 30 °С. Антагонистическую активность оценивали по зонам подавления роста фитопатогена [17].
Выбранные штаммы оценивали на биосовместимость с использованием анализа с поперечными полосами на питательных агаровых средах Кing B (KB), Лурия- Бертани (LB; триптон – 10 г/л, хлорид натрия – 10 г/л, дрожжевой экстракт – 10 г/л, агар микробиологический – 18 г/л, сульфат магния – 12,5 мМ, рН= 7,5) и PDA, линиями перпендикулярно друг другу, чашки Петри инкубировали при 30℃ в течении 48 ч. О совместимости штаммов оценивали по отсутствию зоны подавления роста в местах пересечения линий посевов [18].
Для поддержания консорциума в почве и ризосфере каждый штамм выращивали отдельно в питательной среде LB при 30 ℃ в течении суток в шейкере-инкубаторе ZQZY-78A (Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd., Китай). Далее культуру доводили до 1×107 КОЕ/мл 1 % раствором карбоксиметилцеллюлозы и смешивали в равных пропорциях. Семена пшеницы инкубировали в смеси бактерий в течение 15 минут, высушивали при комнатной температуре в течение 20 минут и сажали в грунт. После 14 суток роста растений пшеницы, делали смывы почвы и корней контрольных (семена растений, необработанные бактериальными консорциумами) и испытуемых (семена растений, обработанные бактериальными консорциумами) растений. Смывы высевали на чашку Петри со средой КБ с содержанием нистатина 50 мкг/мл. Далее для каждого образца (корней и почвы контрольных и опытных растений). Далее подготавливали смывы физраствором (0,5 % раствор хлорида натрия) с корней растений и почвы как контрольных, так и опытных образцов. Через серию разведений смывы высаживали на чашку Петри с питательной средой Кинг Б (КБ) и получали по 36 рандомных изолятов из образцов корней и почвы контрольных и испытуемых растений. Колонии высаживались на чашку Петри с КВ для дальнейшего на наличие и/или отсутствие искомых штаммов. Для проведения ПЦР-типирования выделенных изолятов использовали праймеры к BOX (BOXA1R 5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’) и праймеры к неинвертированным участкам последовательности ERIC анализа методом ПЦР-фингерпринтинга (ERIC1R 5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’, ERIC2 5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’). Программа проведения BOX-ПЦР и ERIC-ПЦР типирования: 95 °С – 3 мин, (95 °С – 20 сек, 53 °С – 1 мин, 65 °С – 8 мин, 34 цикла), 65 °С – 18 мин, хранение – при 12 °С.
Далее проводили электрофоретический анализ полученных продуктов амплификации в агарозном геле и биоинформационную обработку полученных графических данных с помощью программы Bionumerix (Франция). В качестве маркера молекулярных масс использовался DNA Ladder 1 kb (Евроген, номер по каталогу NL001) (полосы с увеличенной яркостью имеют размер 1 т.п.н. и 3 т.п.н.). Кроме того, снимали биометрические показатели растений (сухая масса, длина корней и побегов) и подсчитывали количество растений. Эксперименты проводили в 10 биологических и 3 аналитических повторностях.
Статистический анализ проводили с использованием пакета статистических программ OriginLab pro SR1 b9.5.1.195. Достоверная разница между группами проанализирована с использованием одностороннего ANOVA и апостериорного теста Тьюки на достоверно значимую разницу при p <0,05.
Результаты и обсуждение. Из листьев, почвы и ризосферы дикорастущих растений получено 216 изолятов. Была проведена идентификация на основании сравнения последовательностей гена 16S pPНК. В идентифицированных образцах доминировали штаммы, относящиеся к родам Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter, а также встречались бактерии относящийся к родам Microbacterium, Stenotrophomonas, Leifsonia, Luteimonas и Enterobacter. Из 216 полученных изолятов 32,3 % проявили амилазную активность; 41,7 % липазную активность; 50 % изолятов нитрогеназную активность; 37,6 % протеазную активность; 45,8 % фитазную активность и 32,9 % изолятов продемонстрировали целлюлазную активность. 30 % из полученных изолятов являлись фитопатогенами. Среди них встречались микроорганизмы, относящиеся к роду Pseudomonas, Xanthomonas и Pectobacterium. Из непатогенных штаммов только 31,5 % проявили антагонизм в фитопатогенному грибу F. oxysporum.
После получения всех данных (ферментативная активность, антагонистическая активность) и исключения патогенных бактерий согласно классификации немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур Лейбницкого института (https://www.bacdive.dsmz.de/), был сформирован консорциум из непатогенных и перспективных штаммов, включающая в себя штаммы КМ 24, АНМ79, АНМ 107 и АНМ 109. Штаммы консорциума КМ 24, АНМ79 и АНМ 109 благодаря фитазной и нитрогеназной активности усиливают минеральное питание растений благодаря мобилизации труднодоступных форм фосфора почв и минерализации атмосферного азота. Внеклеточные протеазы, выделяемые штаммами КМ 24 и АНМ79, могут служить одним из фактором антагонистической активности бактерий, позволяя им конкурировать с другими микроорганизмами, в частности фитопатогенами. Наличие амилазной (штамм АНМ 107), липазной (штаммы КМ 24, АНМ 107 и АНМ 109) и целлюлазной активности (штамм АНМ 107) у бактерий способствует разложению растительных остатков в почве и тем самым обогащают её (табл. 1).
Таблица 1 – Ферментативная бактерий, входящих в консорциум, и антагонизм к фитопатогенному грибу F. oxysporum
|
|
Название бактерий по идентичности на базе данных NCBI |
Ферментативная активность |
Антаго-низм к F. oxysporum |
|||||
|
Штамм (источник штамма) |
фитаз-ная |
проте-азная |
липаз-ная |
нитро-геназ-ная |
целлю-лазная |
амилаз-ная |
||
|
АНМ 79 (ризосфера подорожника) |
Stenotropho-monas rhizophila |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
|
АНМ 107 (ризосфера полыни) |
Pseudomonas synxantha |
- |
- |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
|
АНМ 109 (ризосфера полыни) |
Stenotropho-monas rhizophila |
- |
- |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
|
КМ 24 (филоплан камыша) |
Bacillus pumilus |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
Штаммы КМ 24, АНМ 107 и АНМ 109 показали антагонистическую активность к фиопатогенному грибу F. oxysporum, так как отмечали зоны подавления роста фитопатогена (рис. 1).
Рис. 1 – Проверка отобранных штаммов на антагонизм к фитопатогенному грибу F.oxysporum
Штаммы, отобранные по совокупности ферментативных активностей и антагонизму проверяли на биосовместимость. По результатам теста внутри консорциума не было обнаружено конкурентных взаимодействий и подавления роста между штаммами на всех использованных питательных средах – отсутствовали зоны лизиса, не происходила остановка роста культур (рис. 2).
Рис. 2 – Совместимость бактериальных штаммов консорциумов на разных питательных средах (LB, KB, PDA).
В результате проверки поддержания консорциума в почве и ризосфере растений проводили сравнение профилей изолятов с помощью метода ПЦР-фингерпринтинга. Ни один из внесенных штаммов не обнаруживали в контрольном образце (рис. 3 А, В). В образцах почвы и корней пшеницы, обработанной консорциумом штаммов (опытные образцы), встречались изоляты с профилями ПЦР-фингерпринтинга совпадающими с таковыми у внесенных штаммов. Так, в опытных образцах, полученных из смыва корней растений, были обнаружены совпадения между штаммом АНМ109, который использовали в консорциуме, и 6 изолятами (под номерами 9, 13, 23, 27, 28, 34) из 36 изолятов, полученных из корней растений пшеницы, обработанных исследуемым консорциумом (рис. 3 Б).
Также было обнаружено совпадение между штаммом АНМ107, который использовали в консорциуме, и изолятом под номером 33 (рис. 3 Б). Это свидетельствует о том, что после 14 суток роста растений пшеницы, семена которых обработаны консорциумом, только штаммы АНМ 107 и АНМ 109 сохраняются в корнях испытуемых растений. В опытных образцах, полученных из смыва почвы, были обнаружены совпадения между штаммом АНМ109 и 7 выделенными изолятами (под номерами 14, 15, 18, 22, 26, 28, 33) из 36 изолятов, полученных из смыва почвы в которой выращивали обработанные консорциумом исследуемые растения (рис. 3 Г).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что после 14 суток роста пшеницы, семена которой были обработаны созданным консорциумом штаммов бактерий, штаммы АНМ 79, АНМ 107 и АНМ 109 в большем количестве присутствуют в почве, при этом только штаммы АНМ 107 и АНМ 109 обнаруживались на корнях растений.
Рис. 3 – Электрофореграмма ПЦР-фингерпринтинга изолятов, выделенных из смыва: А – корня контрольных растений, Б – корня опытных растений, В – почвы контрольных растений, Г – почвы опытных растений: К1 – АНМ109, К2 – АНМ79, К3 – АНМ107, К4 – КМ24, 1…36 – выделенные штаммы. В качестве маркера молекулярных масс использовалась маркер длин ДНК DNA Ladder 1 kb.
Биометрические показатели растений озимой пшеницы, обработанные консорциумом микроорганизмов, были выше, чем у контрольных растений. Длина побегов опытных растений превышала контрольные образцы на 38,6 % (от 10,6 см в контроле до 14,7 см в опыте), длина корневой системы – на 22,1 % (от 12,2 см в контроле до 14,9 см в опыте) и всхожести семян на 3,0 % (от 87 % в контроле до 90 % в образце) (табл. 2).
Таблица 2 – Данные ростостимулирующих свойств на растений пшеницы созданного консорциума микроорганизмов
|
Признак |
Контроль |
Опыт |
|
Всхожесть, % |
87±0,45 |
90 ± 0,53* |
|
Масса побегов, г |
0,103±0,013 |
0,11±0,013* |
|
Масса корней, г |
0,02±0,004 |
0,04±0,01* |
|
Длина побега, см |
10,6±1,07 |
14,7±1,3* |
|
Длина корней, см |
12,2±1,2 |
14,9±1,0* |
* – достоверно отличается от контроля на уровне значимости p≤0,05.
Выводы. Таким образом, с использованием бактерий из диких растений камыша, подорожника и полыни сформирован консорциум микроорганизмов, включающие в себя Bacillus pumilus (КМ24), Bacillus altitudinis (АНМ79), Pseudomonas synxantha (АНМ107), Arthrobacter nicotinovorans (АНМ109).
Фитазная и протеазная активность выявлена у штамма АНМ 79, выделенного из ризосферы подорожника, и КМ 24 из филоплана камыша. Липазной активностью обладали три штамма из четырех – АНМ 107 и АНМ 109, выделенных из ризосферы полыни, и КМ 24 из филоплана камыша. Нитрогеназная активность была характерная для изолятов АНМ 109 и КМ 24. Целлюлазную активность определили только у штамма КМ 24, как и амилазную – у АНМ 107. У всех штаммов, составляющих консорциум, кроме АНМ 79, выявлен антагонизм к F. oxysporum.
В контрольных образцах (семена растений, необработанные бактериальными консорциумами) почвы и корней пшеницы изучаемые штаммы из диких растений не обнаружены. Консорциум после обработки лучше сохраняется в почве, чем в корнях испытуемых растений.
Обработка семян пшеницы созданным консорциумом способствовала увеличению длины побегов опытных растений, относительно контрольных, на 38,6 % (с 10,6 см до 14,7 см), длины корневой системы – на 22,1 % (с 12,2 см до 14,9 см) и всхожести семян – на 3,0 % (с 87 % до 90 %).
Таким образом, микроорганизмы, ассоциированные с дикорастущими растениями благодаря способности бактерий к мобилизации основных неорганических элементов (азота и фосфора), разложению сложных органических соединений (целлюлозы, крахмала, липидов) и биоконтролю фитопатогенных бактерий, можно использовать при создании биопрепаратов для фитостимуляции культурных растений.
