Введение. На сегодняшний день широкий спектр практического применения синтетического гидроксиапатита [Ca10(PO4)6(OH)2, ГАП] в медицинской практике (в реконструктивной хирургии, ортопедии и стоматологии) в виде биокерамики, цемента и т.д. обусловлен биоактивностью, биосовместимостью и остеокондуктивностью данных материалов [1–4]. Препараты на основе ГАП нетоксичные, не вызывают реакции отторжения и обладают способностью активно связываться со здоровой костной тканью, ускоряя процесс регенерации и реабилитации [5, 6].
Рис. 1. Схемы, иллюстрирующие влияние заряда поверхности биоматериала на адгезию клеток [8]:
а) – нейтральная, b) – положительно заряженная, c) – отрицательно заряженная
Как известно, важными характеристиками биоматериалов, помимо биосовместимости, определяющими их биорезорбируемость и способность к адсорбции белков при вживлении имплантатов в организм, являются электрическая совместимость с биологическими тканями и состояние активных центров поверхности. В 2012 году были опубликованы результаты исследования Tofail с соавторами, которые продемонстрировали рост костной ткани в области отрицательного заряда биоматериала, в то время как у анода, отмечается остеонекроз [7]. В работе [8] также сообщалось о взаимодействии между электрическим поверхностным зарядом биоматериалов и адсорбцией протеинов, которое играет критическую роль в передаче сигналов клеток, регулирующих их дифференцировку. Показано, что катионы кальция преимущественно адсорбируются на отрицательно заряженной поверхности ГАП, формируя апатитовой слой, и инициируют дальнейшую адгезию белков и клеток (рис. 1).
В ряде опубликованных работ [9-11] упоминается, что большое значение для адгезионной активности и пролиферации клеток имеют электроповерхностные свойства, такие как величина, знак и плотность заряда на поверхности материала. Введение в кристаллохимическую структуру ГАП модифицирующих анионов, таких как SiO44-, CO32-, замещающих фосфатные группы, приводит к изменению дзета-потенциала частиц. Поэтому, для понимания взаимодействия клеток с поверхностью необходима информация о поверхностном потенциале биоматериалов, о дзета-потенциале, как и о других свойствах, включая морфологию, и особенно состояние кислотно-основных характеристик поверхности данных биоматериалов.
Известно, что поверхность гидроксиапатита, как и других кальций-фосфатных материалов характеризуется наличием Льюисовских кислотных (Ca2+) и основных (атомы кислорода в PO43ˉ и OH--группах) центров, а также кислотно-основных центров Бренстеда.
Анализ литературных источников [12-14] показывает, что изменение мольного отношения Ca/P в значительной степени влияет на кислотно-основные характеристики поверхности. Соотношение Са/Р ниже стехиометрического, т.е. <1,67, будет способствовать усилению кислотных свойств, тогда как более высокие отношения Ca/P ведут к преобладанию основных.
Также поверхностные кислотно-основные свойства ГАП можно регулировать путём замещения Ca2+, ОН-групп или групп PO43- на вакансии, катионы Sr2+, Mg2+, Na+, K+, анионы F-, Cl-, CO32- и анионы HPO42-, CO32-, SiO44- и т.д. соответственно. Внедрение различных модифицирующих ионов в кристаллохимическую структуру ГАП может существенно влиять на распределение кислотно-основных центров Льюиса и Бренстеда [15].
Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы являлось исследование влияния состава кристаллохимической структуры кальций-фосфатных наноструктурных композиционных материалов на формирование электроповерхностных и кислотно-основных характеристик синтезированных продуктов.
Материалы и методы. В настоящей работе были исследованы образцы силикат- и карбонат-замещенных гидроксиапатитов - Si-ГАП и КГАП соответственно, а также биомиметического кальций-фосфатного нанокомпозита (БМГАП), допированного силикат- и карбонат-анионами, синтезированные путем осаждения из водных растворов. Для проведения синтеза в качестве исходных реактивов использовали Ca(NO3)2×4H2O (ч. д. а.), (NH4)2HPO4 (ч. д. а.), (C2H5O)4Si (тетраэтоксисилан) (ос. ч.), (NH4)2CO3 (ч. д. а.) и NH4OH (х. ч. а.). Синтез проводили при комнатной температуре (t = 22±2 °С) и рН=10±0,5. рН поддерживали добавлением 25 % раствора NH4OH. Образовавшийся молочно-белый осадок выдерживали в маточном растворе в течение 24 часов для завершения фазообразования. Далее твердую фазу отделяли фильтрованием, хорошо промывали, высушивали при температуре t = 105±5 °С до постоянной массы и измельчали до порошкообразного состояния. Более подробно методики синтеза описана в [16-18].
Процесс синтеза Si-ГАП, КГАП и БМГАП можно описать следующими уравнениями:
Синтез Si-ГАП:
Синтез КГАП:
Синтез БМГАП:
Объектом сравнения в данной работе был выбран стехиометрический немодифицированный гидроксиапатит, синтезированный в соответствии с уравнением:
Качественный и количественный элементный состав синтезированных образцов были определены методом рентгеноспектрального микроанализа (РСМА) с использованием энергодисперсионного анализатора рентгеновского излучения фирмы EDAX, который встроен в сканирующий электронный микроскоп Quanta – 200 3D фирмы FEI (США).
Измерение электрокинетического потенциала (z-потенциал) синтезированных образцов, находящихся во взвешенном состоянии в дистиллированной воде, было выполнено на анализаторе серии «Zetasizer Nano ZS» компании Malvern Instruments (Великобритания), использующего электрофоретическое рассеяние света. Измерение z-потенциала осуществляли при фиксированных значениях рН раствора.
Кислотно-основные свойства поверхности синтезируемых образцов определяли методом адсорбции одноосновных индикаторов на поверхности твердофазных веществ из водной среды методом Гаммета [19, 20]. Были выбраны индикаторы, позволяющие контролировать концентрацию и силу кислотно-основных центров в диапазоне значений рН от -0,3 до +12,8 (табл. 1). Исходная концентрация индикаторов в растворе составляла 0,0006 моль-экв/л (0,0006 ммоль-экв/мл).
Количественное определение центров адсорбции (qpKax, ммоль-экв/г) выполняли спектрофотометрическим методом с использованием спектрофотометра Spekord-50 по следующей методике. Навеску каждого исследуемого образца массой 0,02 г помещали в калиброванные пробирки, приливали определенное количество раствора индикатора (табл. 1) и дистиллированной водой доводили объем до 5 мл, тщательно перемешивали и выдерживали в течение 1 час. После установления адсорбционного равновесия отделяли жидкую фазу декантацией и измеряли значение оптической плотности А1 при длине волны (λmax), соответствующей каждому индикатору (табл. 1). Одновременно проводили холостой опыт, учитывающий влияние взаимодействия образца с растворителем на изменение оптической плотности в процессе адсорбции красителя. Для этого навески образца (m2 ~ m1) заливали 3 мл воды, через час декантировали раствор в другую пробирку, добавляли необходимый объем индикатора, разбавляли водой до 5 мл, перемешали и выдержали в течении 30 минут и измеряли значение оптической плотности (A2), соответствующее изменению окраски индикатора за счет изменения pH среды при контакте образца с растворителем. при длине волны, соответствующей максимальному поглощению каждого индикатора (λmax).
Данная методика позволяет проводить количественное определение суммарной кислотности по Льюису и Бренстеду с дифференциацией реакционных центров по типу и силе в зависимости от pKax индикатора. Ассортимент используемых кислотно-основных индикаторов представлен в табл. 1.
Таблица 1
Характеристики кислотно-основных индикаторов, использованных в настоящей работе
|
Название индикатора |
Vинд., мл |
V(H2O), мл |
pKa |
λmax (нм) |
|
Орто-нитроанилин |
2 |
3 |
–0,3 |
410 |
|
Пара-нитроанилин |
0,2 |
4,8 |
+1,02 |
340 |
|
Кристаллический фиолетовый |
2 |
3 |
+0,80 |
580 |
|
Бриллиантовый зеленый |
0,5 |
4,5 |
+1,30 |
610 |
|
Фуксин (основание) |
1 |
4 |
+2,1 |
540 |
|
Метиловый оранжевый |
0,5 |
4,5 |
+3,46 |
460 |
|
Бромфеноловый синий |
0,2 |
4,8 |
+4,10 |
690 |
|
Метиловый красный |
0,5 |
4,5 |
+5,0 |
430 |
|
Бромкрезоловый пурпур. |
0,8 |
4,2 |
+6,4 |
540 |
|
Бромтимоловый синий |
0,8 |
4,2 |
+7,3 |
430 |
|
Феноловый красный |
1 |
4 |
+8,0 |
430 |
|
Тимоловый синий |
1 |
4 |
+8,8 |
430 |
|
Индигокармин |
0,5 |
4,5 |
+12,8 |
610 |
Содержание активных центров данной кислотной силы, эквивалентное количеству адсорбированного индикатора, рассчитывали по формуле:
где Сind – концентрация раствора индикатора, ммоль-экв/мл; Vind – объем раствора индикатора, взятого для анализа, мл; A1 – оптическая плотность раствора индикатора после сорбции; A2 – оптическая плотность «холостого» раствора; A0 – оптическая плотность раствора индикатора до сорбции; m1 и m2 – масса сорбента при измерении A1 и A2, г; знак «–» соответствует однонаправленному изменению А1 и А2 относительно А0, а знак «+» - разнонаправленному.
На основании полученных данных строили кривые распределения кислотно-основных центров на поверхности исследуемых образцов в координатах qpKax=f(pKax).
Основная часть. Ранее, в работах [16, 17] методом рентгенофазового анализа было доказано, что синтезированные порошки, модифицированные силикат-анионами (Si-ГАП) и карбонат-анионами (КГАП), а также БМГАП являются наноструктурными однофазными продуктами и они могут быть идентифицированы как модификации гидроксиапатита (по ICDD № 01-072-1243). Установлено, что полученные образцы Si-ГАП, КГАП и БМГАП кристаллизуются в гексагональной структуре ГАП с пространственной группой P63/m.
Из литературных данных [21, 22] известно, что важной характеристикой кальций-фосфатных материалов является мольное соотношение Ca/P, которое определяет такие свойства материалов, как скорость растворения и механические свойства. Так, чем ниже соотношение Ca/P, тем выше растворимость материала и ниже механические показатели. Наоборот, с увеличением соотношения Ca/P до 1,67 (то есть соответствующего формуле стехиометрического ГАП), скорость растворения кальций-фосфатного материала снижается, а его механические свойства увеличиваются и достигаются до максимального значения. Следует отметить, что для биогенного гидроксиапатита, значение Ca/P варьируется в пределах от 1,37 до 2,07 в зависимости от различных условий.
Согласно исследованию методом РСМА (рис. 2), помимо кислорода, кальция и фосфора, в модифицированных порошковых образцах Si-ГАП, КГАП и БМГАП присутствуют еще такие элементы как кремний и углерод.
Рис. 2. Энергодисперсионные спектры элементного анализа синтезированных образцов:
а) – ГАП; б) – Si-ГАП; в) – КГАП и д) – БМГАП
В таблице 2 представлено количественное содержание Ca, P, Si и C в синтезированных
образах ГАП, Si-ГАП; КГАП и БМГАП.
Таблица 2
Элементный состав синтезированных образцов
|
Элемент |
Количественное содержание, атом., % |
|||
|
ГАП |
Si-ГАП |
КГАП |
БМГАП1,50 |
|
|
Ca |
27,92 |
27,05 |
28,82 |
26,27 |
|
P |
16,82 |
13,7 |
16,08 |
13,42 |
|
Si |
- |
2,65 |
- |
2,83 |
|
C |
- |
- |
1,22 |
1,30 |
|
Мольное отношение |
Ca/P |
Ca/(P+Si+C) |
||
|
1,66 |
1,65 |
1,66 |
1,49 |
|
По данным, приведенным в табл. 2, видно, что для немодифицированного гидроксиапатита соотношение Ca/P равно 1,66; а для ряда модифицированных образцов Si-ГАП, КГАП, а также БМГАП соотношение Ca/(P+Si+C) составляют 1,65; 1,66 и 1,49, соответственно. Все синтезированные образцы имели фактическое мольное отношение близкое к проектному значению. По результатам РСМА также наблюдается незначительное уменьшение фактических значений Ca/(P+Si+C), вероятно, связано с тем, что часть непрореагировавших анионов SiO44- и CO32- остаются в маточном растворе.
Следует отметить, что по сравнению со стехиометрическим немодифицированным ГАП, повышение мольного соотношения кальция к фосфору в исследуемых образцах Si-ГАП, КГАП и БМГАП может служить доказательством изоморфных замещений в кристаллографической структуре гидроксиапатита.
Одним из важных свойств кальций-фосфатных материалов, применяемых в качестве субстратов для изготовления костных имплантатов, помимо биосовместимости, механических характеристик, остеоиндуктивности, крайне важными являются электроповерхностные свойства. Известно [23], что, в случае помещения биоматериала внутрь организма сразу возникает биологическая ответная реакция на глубине в несколько нанометров от поверхности. В тоже время, наличие поверхностного заряда на границе между биоматериалом и биологической средой оказывает существенное влияние на процессы адсорбции белка и клеточной адгезии. С этой точки зрения частицы ГАП, несущие отрицательный поверхностный заряд, имеют заметное преимущество.
Полученные значения z-потенциала, измеренные при рН=7, для водных суспензий синтезированных образцов ГАП, Si-ГАП, КГАП и БМГАП приведены в табл. 3 и на рис. 3.
Рис. 3. Кривая распределения z-потенциала поверхности синтезированных образцов:
а) – ГАП; б) – БМГАП
Таблица 3
Значение z-потенциала синтезированных образцов при рН=7
|
Исследуемый образец |
z-потенциал, мВ |
|
ГАП |
-1,05 |
|
Si-ГАП |
-1,54 |
|
КГАП |
+8,45 |
|
БМГАП |
-4,29 |
По результатам исследования поверхностного заряда синтезированных образцов методом электрофоретического рассеяния света при фиксированных значениях рН было показано, что в водной суспензии частицы исследуемых образцов ГАП, Si-ГАП и БМГАП несут отрицательный заряд, а для КГАП - положительный. Полученные результаты хорошо согласуются с литературным данным [24, 25]. Следует отметить, что в случае для БМГАП, при введении силикат- и карбонат-анионов в кристаллохимическую структуру ГАП наблюдается увеличение отрицательных значений z-потенциала от -1,05 до - 4,29 мВ.
Таким образом, для модифицированных образцов как SiГАП, КГАП, так и для БМГАП имеет место широкий диапазон варьирования величины отрицательного поверхностного заряда, что позволяет управлять их адгезионными свойствами по отношению к клеткам и протеинам.
Наряду с электрокинетическими свойствами биоматериалов, определяющие их биорезорбируемость и способность к адгезии белков при вживлении имплантатов в организм человека, другой важной характеристикой является состояние кислотно-основных поверхностных центров.
На рис. 4 представлено распределение содержания кислотно-основных активных центров поверхности в зависимости от синтезированных образцов ГАП, Si-ГАП, КГАП и БМГАП от pKax индикатора.
Рис. 4. Распределение активных центров на поверхности синтезированных образцов
Из рисунка 3 видно, что у всех исследованных образцов преобладают бренстендовские кислотные и нейтральные центры. Немодифицированный ГАП, силикат-замещенный (SiГАП), карбонат-замещенный ГАП (КГАП) и БМГАП характеризуются наличием кислотных центров с pKa = +1,3, pKa = +5 и pKa = +7,1. Установлено, что у образцов БМГАП и ГАП преобладают нейтральные центры Бренстеда. Максимальное количество активных центров, соответствующих показателю кислотности pKa = +7,1, обнаружено у образца БМГАП и их концентрация составляет 48,38 ммоль-экв/г.
Известно, что кислотно-основные свойства поверхности синтетических гидроксиапатитов зависит от двух типов кислотных центров: Льюисовские и Бренстедовские кислотные центры (рис. 5) [15, 26]. На рис. 5 видно, что частицы HPO42– действуют как первые, в то время как вакансии Ca2+ или OH- приводят к вторым. Это объясняет, почему кальций-дефицитный гидроксиапатит с мольным отношением Са/P <1,67 имеет большее количество кислотных центров. Это может быть связано с вкладом HPO42– в кристаллохимической структуре ГАП или OH- - вакансии. Следовательно, кальций-дефицитный ГАП более кислый и преобладает больше кислотных центров Бренстеда по сравнению со стехиометрическим ГАП.
Рис. 5. Модель адсорбции 2-фенилэтиламина (используемого в качестве молекулы зонда) по кислотным центрам Льюиса и Бренстеда на поверхности ГАП [(δ+) = OH - вакансии] [26]
Выводы
1. Образцы силикат-замещенного (SiГАП), карбонат-замещенного (КГАП) и биомиметического кальций-фосфатного нанокомпозита (БМГАП), допированного силикат- и карбонат-анионами были синтезированы методом осаждения из водных растворов. Установлено, что полученные образцы являются наноструктурными однофазными продуктами и они могут быть идентифицированы как модификации ГАП. Методом РСМА было показано, что все синтезированные образцы имели фактическое мольное отношение близкое к проектному значению.
2. Установлено, что в водной суспензии (рН = 7) частицы образцов SiГАП и БМГАП несут отрицательный заряд, а для КГАП – положительный поверхностный заряд. Введение SiO44- и CO32- в кристаллохимическую структуру ГАП приводит к изменению z-потенциала частиц полученных образцов.
3. Выявлено, что у всех исследованных образцов преобладают бренстендовские кислотные и нейтральные центры. Максимальное количество активных центров обнаружено у образца БМГАП, и их концентрация составляет 48,38 ммоль-экв/г.
