Россия
Россия
УДК 577.21 Молекулярные механизмы кодирования, запасания и реализации наследственной информации. Молекулярная биология гена (молекулярная генетика). Молекулярные механизмы матричного синтеза (биополимеризация)
Целью исследований являлось изучение аллельного полиморфизма генов липидного обмена (OLR1, DGAT1 и LEP) у коров холмогорской породы татарстанского типа. Объектом исследования было 79 первотёлок, содержащиеся в СХПК «Агрофирма Рассвет» Кукморского района Республики Татарстан. В результате молекулярно-генетических исследований (ПЦР-ПДРФ и АС-ПЦР) поголовье животных распределили по группам с учётом их генотипа по локусам генов рецептора липопротеина низкой плотности (OLR1), диацилглицерол-О-ацилтрансферазы (DGAT1) и лептина (LEP). Животные с разными генотипами изучаемых генов дополнительно разбили по группам с учётом их линейной принадлежности. Выборка первотёлок состояла из особей, принадлежащих к двум ведущим генеалогическим линиям голштинской породы, а именно: Вис Айдиал 933122 и Рефлекшн Соверинг 198998. В целом исследования показали, что в стаде первотёлок татарстанского типа преобладали аллель C (0,73) и генотип СС 49,4 % гена OLR1; аллель А (0,77) и генотип АА 57,0 % гена DGAT1; аллель C (0,59) и генотип СТ 57,0 % гена LEP. В изучаемом поголовье генетическое равновесие не смещено ни по одному исследуемому гену. У коров частота по встречаемости аллелей генов OLR1, DGAT1 и LEP в зависимости от линейной принадлежности (В. Айдиал и Р. Соверинг) примерно одинаковая. Получены схожие данные, что с учётом принадлежности к голштинской породе наибольшая встречаемость аллелей у первотёлок: C (0,68-0,81) по гену OLR1, А (0,74-0,83) по гену DGAT1 и C (0,57-0,60) по гену LEP, соответственно.
корова, ПЦР, ДНК, полиморфизм, генотип, ген OLR1, DGAT1, LEP
Введение. Успех селекции в значительной степени зависит от точности определения племенной ценности животных. В связи с этим ценность методов, помогающих выявить лучших животных и предсказать их племенные качества в раннем возрасте возрастает. Достижения современной молекулярной генетики позволяют определить гены, которые контролируют экономические признаки. В дополнение к традиционному отбору животных, выявление вариантов генов позволит проводить селекцию непосредственно на уровне ДНК [1].
Ген OLR1 обнаруженный в 30-UTR связан с составом молока в различных популяциях молочного скота. В молочном скотоводстве коровы с генотипом СС имели более высокие показатели по молочному жиру, массовой доле жира в молоке, чем у аналогов генотипа АА [2, 3]. Ген OLR1 также влияет на количество отложений жира в туше и «мраморность» говядины [4].
При исследовании генотипов гена OLR1 при одной базовой мутации у крупного рогатого скота в Иране было обнаружено, что частота встречаемости генотипов были почти одинаковыми для генотипов AA, AC и CC, а именно 0,22, 0,50 и 0,28 соответственно; в то время как частота встречаемости аллелей A и C были 0,47 и 0,53 соответственно, средние значения продуктивности животных с генотипами OLR1 составили 8273 кг (CC), 8344 кг (AC) и 7178 кг (AA) по удою; 276,3 кг (CC), 277,6 кг (AC) и 239,7 кг (AA) по выходу молочного жира и белка, 286,7 кг (CC), 290,5 кг (AC) и 253 кг (AA), (АС) и 253 кг (АА) (P<0,05) [5]. Почти аналогичная частота для аллелей А и С были также зарегистрирована у крупного рогатого скота в США, а именно 0,46 и 0,54 [6], и у крупного рогатого скота в Польше, а именно 0,43 и 0,57 [7]. В другом исследование на том же базовом маркере g.8232CNA в не трансляционной области 3' UTR гена OLR1 у красно-белой породы польского скота определена частота генотипов с наибольшей последовательностью для CC (0,53), AC (0,34) и AA (0,13) [8]. Коровы с генотипом CC имели самый высокий процент жира в молоке, в тоже время с генотипом AA – самый низкий, а генотип AC – промежуточный (P<0,05) [9].
Полиморфизм DGAT1 A232K как было показано ранее, оказывает значительное влияние на показатели молочной продуктивности (выход молока, содержание белка и жира, жирнокислотный состав). При изучении частот встречаемости аллелей была выявлена значительная степень разнообразия в зависимости от рассматриваемой популяции, что вызвано разными целями разведения, относительно состава молока у разных пород и в разных странах. Достоверное снижение содержания белка в молоке и удоя, увеличение содержания жира в молоке было связано с заменой на лизин (К-аллель). Вариант с заменой на аланин (А-аллель) был связан с увеличением содержания белка в молоке и удоя, но снижением количества жира в молоке [10].
Генотипирование K232A в гене DGAT1 выявило чёткое географическое распределение частот генотипов. Частоты аллелей К и А составляют 0,1667 и 0,8333, соответственно, что указывает на то, что частота аллеля А у голштинского скота значительно выше, чем у китайского скота. Также существует значительная корреляция между полиморфизмом генотипов KK, KA и AA гена DGAT1 с массовой долей жира в молоке. Аллель А в основном фиксируется у северного китайского скота (Bos taurius), в то время как аллель K доминирует у южно-китайского скота (Bos indicus), предопределяя то, что северная группа крупного рогатого скота имеет более низкое содержание молочного жира, чем у южной группы крупного рогатого скота [11].
При изучении аллельного полиморфизма гена DGAT1 у местного иракского скота выявлено, что частоты генотипов KK, KA и AA составили 0,40, 0,30 и 0,30, соответственно. Частота аллелей K и A составила 0,60 и 0,40, соответственно. Генотип KK был значительно (P<0,05) связан с более высоким показателем количества молочного жира. Таким образом, ген DGAT1 может служить генетическим маркером для селекции на показатель жира в молоке у коров [12].
Исследования показали, что ген DGAT1 влияет на удой и состав молока у итальянских голштинов [13], белых пород крупного рогатого скота фулани и боргу [14], симментальской и бурой швейцарской пород крупного рогатого скота в Хорватии [15].
В экзоне 8 полиморфизм обнаружено не было. Таким образом, позиция K232A была признана консервативной и скрепленным регионом для высокого содержания молочного жира (аллель K) у Bos indicus и всех пород буйволов [16].
При изучении генетических изменений в гене лептина у пород крупного рогатого скота (восточно-анатолийская красная и анатолийская черная), частоты аллелей Т и С составили 0,54 и 0,46 для восточно-анатолийского красного скота, 0,48 и 0,52 для анатолийского черного, соответственно. Результаты статистического анализа показали, что встречаемость генотипа ТТ у анатолийской черной породы был выше, чем других генотипов CC и CT (Р<0,05). Эти результаты показывают, что генотип лептина TT связан с увеличением окружности грудной клетки. Эти сведения могут представлять экономический интерес [17].
При изучении полиморфизма гена лептина полиморфизма экзона 3 (локус A59V) и интрона 2 (локус SAU3AI) в находящейся под угрозой исчезновения популяции автохтонного скота был обнаружен один генотип A59V (CC), и два SAU3AI генотипа, AA и AB, с частотой 78,26 % и 21,74 %, соответственно [18].
Среди коров голштинской породы Республики Татарстан частота встречаемости аллелей C и T у изучаемого гена составила: 0,570 и 0,430 соответственно. Наблюдаемое распределение генотипов было следующим: TT – 18,4 %; TC – 49,1 %; CC – 32,5 %, что говорит о полиморфной популяции. Полученные данные указывают на разнообразие генетической структуры голштинской популяции крупного рогатого скота Республики Татарстан. Изучая ассоциации гена лептина с динамикой молочной продуктивности за три лактации коров голштинской породы выявлено, что наилучшие показатели по всем трем лактациям были выявлены в группе животных с генотипом TT гена LEP [19].
После проведения ДНК-исследования скота японского черного скота определены частоты аллелей гена LEP C и T в соотношении 0,71 и 0,29, соответственно [20].
По данным исследований на голштинском скоте Татарстана распределение частот аллелей С (А) и Т (В) гена LEP было следующим: С - 0,41-0,62 и Т - 0,38-0,59 [21, 22].
В связи с вышесказанным нами поставлена цель – изучить аллельный полиморфизм генов липидного обмена (OLR1, DGAT1 и LEP) у коров холмогорской породы татарстанского типа.
Условия, материалы и методы. Исследования проводились в СХПК «Агрофирма Рассвет» Кукморского района Республики Татарстан.
Предметом исследования были пробы цельной крови, отобранные для исследования от 79 коров холмогорской породы татарстанского типа.
В исследовании поголовье первотёлок было представлено только двумя ведущими генеалогическими линиями голштинской породы, а именно: Вис Айдиала 933122 и Рефлекшн Соверинга 198998.
ДНК из исследуемых проб крови выделяли при помощи коммерческого набора «Рибо-преп» (производитель ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), согласно утверждённой производителем инструкции к набору.
Генотипирование коров по генам OLR1, DGAT1 и LEP выполнили методом ПЦР-ПДРФ и АС-ПЦР с использованием ДНК-амплификатор DNA Engine РТС (США). Для амплификации специфичного фрагмента гена OLR1 длиной 143 bp применяли праймеры OLR1-F: 5/-TCCCTAACTTGTTCCAAGTCCT-3/ и OLR1-R: 5/-CTCTACAATGCCTAGAAGAAAGC-3/. При проведении ПДРФ-анализа OLR1-гена 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 20 ед. эндонуклеазы рестрикции PstI в 1×буфере «O» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С в течение ночи.
Для амплификации специфичного фрагмента гена DGAT1 длиной 100 bp применяли праймеры DGAT1-1: 5/-ccgcttgctcgtagctttcgaaggta acgc-3/, DGAT1-2: 5/-ccgcttgctcgtagctttggcaggtaacaa-3/, DGAT1-3: 5/-AGGATCCTCACCGCGGTAGGTCAGG-3/ [23]. Для проведения ПДРФ-анализа DGAT1-гена 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 20 ед. эндонуклеазы рестрикции TaqI в 1×буфере «Y» фирмы СибЭнзим (Россия) при 65 0С в течение ночи.
Для амплификации аллель-специфичных фрагментов гена LEP длиной 239 bp, 164 bp и/или 131 bp применяли праймеры LEP-F1: 5/-GACGATGTGCCACGTGTGGTTTCTTCTGT-3/, LEP-R1: 5/-CGGTTCTACCT CGTCTCCCAGTCCCTCC-3/, LEP-F2: 5/-TGTCTTACGTGGAGGCTGTGCCC AGCT-3/, LEP-R2: 5/-AGGGTTTTGGTGTCATCCTGGACCTTTCG-3/ [24].
Анализ результатов цельных фрагментов, ПЦР-ПДРФ- и АС-продуктов выполняли с использованием комплекта реагентов для проведения гель-электрофореза, производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Фиксирование результатов выполняли гель-документирующей системой GelDoc X+ (Bio-Rad).
По результатам генотипирования крупного рогатого скота рассчитали частоту встречаемости аллелей и генотипов по генам OLR1, DGAT1 и LEP.
Частоту встречаемости аллелей и генотипов, наблюдаемую и ожидаемую частоты генотипов, хи-квадрат в популяции рассчитывали по общепринятым формулам, используемым в ветеринарной генетике с основами вариационной статистики.
Результаты и обсуждение. Изучение генетической структуры отдельной популяции сельскохозяйственных животных позволяет сохранить ценный генофонд и выбрать наиболее эффективные методы селекции. Установлено, что в изучаемом стаде скота 49,4 % животных несли генотип OLR1 гена CC, тогда как генотипы OLR1 AC и OLR1 AA составили 46,8 % и 3,8 %, соответственно. Частота аллелей OLR1 A и OLR1 C по стаду составила 0,27 и 0,73, соответственно (табл. 1).
Таблица 1 - Полиморфизм гена рецептора липопротеина низкой плотности (OLR1) у коров
|
Показатель |
n |
Частота генотипа |
Частота аллеля |
χ2 |
||||||
|
АА |
АС |
СС |
||||||||
|
n |
% |
n |
% |
n |
% |
А |
С |
|||
|
О |
79 |
3 |
3,8 |
37 |
46,8 |
39 |
49,4 |
0,27 |
0,73 |
2,88 |
|
Е |
6 |
7,6 |
31 |
39,2 |
42 |
51,2 |
||||
Примечание: О – фактически наблюдаемый показатель, Е – теоретически ожидаемый показатель
Также исследования по гену OLR1 показали, что чаще встречаются коровы с генотипами OLR1 CC линии Р. Соверинга (63,0 %) и OLR1 AC линии Айдиала (51,9 %). Частота встречаемости аллелей OLR1 A и OLR1 C в стаде по линиям голштинской породы (В. Айдиал, Р. Соверинг) была в пределах 0,19-0,32 и 0,68-0,81, соответственно.
У первотёлок с разными генотипами по гену DGAT1 наиболее часто встречаются коровы с гомозиготным генотипом DGAT1 AA (57,0 %). Животных с генотипом DGAT1 AK – 40,5 %, наименьшее количество выявлено с генотипом DGAT1 KK (2,5 %). Наибольшей встречаемостью обладал аллель DGAT1 A (0,77), который преобладал над аллелем DGAT1 K (0,23) (табл. 2).
Таблица 2 - Полиморфизм гена диацилглицерол-О-ацилтрансферазы (DGAT1) у коров
|
Показатель |
n |
Частота генотипа |
Частота аллеля |
χ2 |
||||||
|
AA |
AK |
KK |
||||||||
|
n |
% |
n |
% |
n |
% |
А |
K |
|||
|
О |
79 |
45 |
57,0 |
32 |
40,5 |
2 |
2,5 |
0,77 |
0,23 |
1,66 |
|
Е |
47 |
59,5 |
28 |
35,4 |
4 |
5,1 |
||||
Примечание: О – фактически наблюдаемый показатель, Е – теоретически ожидаемый показатель
По результатам исследований первотёлок с разными генотипами гена DGAT1 установлено преобладание генотипа DGAT1 AA, частота встречаемости составила 66,7 % по линии Р. Соверинга и 51,9 % по линии В. Айдиала. Частота аллеля A гена DGAT1 (0,74-0,83) у животных с разными генеалогическими линиями по голштинской породе выше, чем аллеля K гена DGAT1 (0,17-0,26).
Анализ полиморфизма гена LEP позволил выявить, что наибольшая встречаемость у коров по гетерозиготному генотипу LEP CT (57,0 %). По гомозиготным генотипам LEP CC и LEP TT частота встречаемости ниже и составила 30,4 % и 12,6 %, соответственно. Различия по частоте встречаемости аллелей LEP C и LEP T по стаду составили 0,59 и 0,41, соответственно (табл. 3).
По распределению частот генотипов у первотёлок в зависимости от линейной принадлежности к голштинской породе установлено схожее соотношение. Наибольшая встречаемость генотипов LEP CT линии В. Айдиала (57,7 %) и линии Р. Соверинга (55,7 %). Частота встречаемости аллелей LEP C и LEP T в популяции с разными линиями голштинской породы находилась в пределах 0,57-0,60 и 0,40-0,43, соответственно.
Таблица 3 - Полиморфизм гена лептина у коров (LEP)
|
Показатель |
n |
Частота генотипа |
Частота аллеля |
χ2 |
||||||
|
CC |
CT |
TT |
||||||||
|
n |
% |
n |
% |
n |
% |
C |
T |
|||
|
О |
79 |
24 |
30,4 |
45 |
57,0 |
10 |
12,6 |
0,59 |
0,41 |
2,55 |
|
Е |
28 |
35,4 |
38 |
48,1 |
13 |
16,5 |
||||
Примечание: О – фактически наблюдаемый показатель, Е – теоретически ожидаемый показатель
Схожие результаты по полиморфизму генов липидного обмена (OLR1, DGAT1 и LEP), в т.ч. в разрезе линейной принадлежности к голштинской породе получены в наших ранних исследованиях, проведённых на быках-производителях чёрно-пёстрой породы: по генам рецептора липопротеина низкой плотности [25], диацилглицеро-О-ацилтрасферазы и лептина [26].
Вывод. В стаде коров преобладали аллель C (0,73) и генотип СС 49,4 % гена OLR1; аллель А (0,77) и генотип АА 57,0 % гена DGAT1; аллель C (0,59) и генотип СТ 57,0 % гена LEP. В изучаемой выборке генетическое равновесие не смещено ни по одному исследуемому гену. У первотелок частота встречаемости аллелей генов OLR1, DGAT1 и LEP в зависимости от линейной принадлежности (В. Айдиал и Р. Соверинг) примерно одинаковая. Получены схожие данные, что с учётом принадлежности к голштинской породе наибольшая встречаемость аллелей у первотёлок: C (0,68-0,81) по гену OLR1, А (0,74-0,83) по гену DGAT1 и C (0,57-0,60) по гену LEP, соответственно.
1. Effect of BsaA I genotyped intronic SNP of leptin gene on production and reproduction traits in Indian dairy cattle / T. Yadav, A. Magotra, Y. C. Bangar et al. // Animal Biotechnology. 2021. V. 34 (2). pp. 261-267. http://doi.org/10.1080/10495398.2021.1955701.
2. Additional support for an association between OLR1 and milk fat traits in cattle / H. Khatib, G. Rosa, K. Weigel et al. // Animal Genetics. 2007. V. 38. pp. 308-310. https://doi.org/10.1111/j.1365-2052.2007.01584.x.
3. Short communication: A mutation in the 3′ untranslated region diminishes microRNA binding and alters expression of the OLR1 gene / X. Wang, T. Li, H. B. Zhao et al. // J. Dairy Sci. 2013. V. 96. pp. 6525-6528. https://doi.org/10.3168/jds.2013-6873.
4. Allele frequencies of gene polymorphisms related to economic traits in Bos taurus and Bos indicus cattle breeds / M. Kaneda, B. Z. Lin, S. Sasazaki et al. // Animal Science Journal. 2011. V. 82. pp. 717-721. https://doi.org/10.1111/j.1740-0929.2011.00910.x.
5. Mashhadi M. H. A research on association between SCD1 and OLR1 genes and milk production traits in Iranian Holstein dairy cattle // Iranian J. of Applied Animal Sci. 2017. V. 7 (2). pp. 243-248.
6. Association of the OLR1 gene with milk composition in Holstein dairy cattle / H. Khatib, S. D. Leonard, V. Schutzkus et al. // J. Dairy Sci. 2006. V. 89. pp. 1753-1760. http://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(06)72243-3.
7. Komisarek J., Dorynek Z. Effect of ABCG2, PPARGC1A, OLR1 and SCD1 gene polymorphism on estimated breeding values for functional and production traits in Polish Holstein-Friesian bulls // J. Appl. Genet. 2009. V. 50 (2). pp. 125-132. http://doi.org/10.1007/BF03195663.
8. Luczak I. K., Piątkowska E. C. Polymorphism in the OLR1 gene and functional traits of dairy cattle // Veterinarski Arhiv. 2018. V. 88. № 2. pp. 171-177. https://doi.org/10.24099/vet.arhiv.170228.
9. Ghombavani M. S., Mahyar S. A., Edriss M. A. Association of a polymorphism in the 3' untranslated region of the OLR1 gene with milk fat and protein in dairy cows // Archiv Tierzucht. 2013. V. 56. № 32. pp. 328-334. https://doi.org/10.7482/0003-9438-56-032.
10. Effect of the DGAT1 K232A genotype of dairy cows on the milk metabolome and proteome / J. Lu, S. Boeren, T. van Hooijdonk et al. // J. Dairy Science. 2015. V. 98 (5). pp. 3460-3469. https://doi.org/10.3168/jds.2014-8872.
11. DGAT1 K232A polymorphism is associated with milk production traits in Chinese cattle / F. Li, C. Cai, K. Qu et al. // Animal Biotechnology. 2021. V. 32 http://doi.org/10.1080/10495398.2020.1711769.
12. Faraj S. H., Ayied A. Y., Seger D. K. DGAT1 gene polymorphism and its relationships with cattle milk yield and chemical composition // Periódico Tchê Química. 2020. V. 17. № 35. pp. 174-180.
13. Short communication: Association analysis of diacylglycerol acyltransferase (DGAT1) mutation on chromosome 14 for milk yield and composition traits, somatic cell score, and coagulation properties in Holstein bulls / T. Bobbo, F. Tiezzi, M. Penasa et al. // Journal of Dairy Science. 2018. V. 101 (9). pp. 8087-8091. http://doi.org/10.3168/jds.2018-14533.
14. Effect of breed and Diacylglycerol acyltransferase 1 gene polymorphism on milk production traits in Beninese White Fulani and Borgou cows / I. Houaga, A. W. T. Muigai, M. Kyallo et al. // Global Journal of Animal Breeding and Genetics. 2017. V. 5 (5). pp. 403-412.
15. Effect of DGAT1 gene variants on milk quantity and quality in Holstein, Simmental and Brown Swiss cattle breeds in Croatia / A. Dokso, A. Ivanković, E. Zečević, M. Brka // Mljekarstvo. 2015. V. 65 (4). pp. 238-242. https://doi.org/10.15567/mljekarstvo.2015.0403.
16. Exploring novel single nucleotide polymorphisms and haplotypes of the diacylglycerol O-acyltransferase 1 (DGAT1) gene and their effects on protein structure in Iranian buffalo / M. Naserkheil, S. R. Miraie-Ashtiani, M. Sadeghi et al. // Genes & Genomics. 2019. V. 41. pp. 1265-1271. https://doi.org/10.1007/s13258-019-00854-2.
17. Breed characteristics associated with LEP gene polymorphisms in Holstein cattle / E. V. Machulskaya, N. V. Kovalyuk, L. G. Gorkovenko et al. // Russ. Agricult. Sci. 2017. V. 43. pp. 314-316. https://doi.org/10.3103/S1068367417040097.
18. Insight in leptin gene polymorphism and impact on milk traits in autochtonous busha cattle // M. Milan, P. Nevres, L. Miodrag et al. // Acta Veterinaria-Beograd. 2019. V. 69 (2). pp. 153-163. https://doi.org/10.2478/acve-2019-0012.
19. Genetic parameters of milk productivity for three lactations of Holstein cattle with different genotypes of LEP gene / T. M. Akhmetov, N. Yu. Safina, A. M. Alimov, M. I. Varlamova // BIO Web of Conferences. 2020. V. 27. 00061. https://doi.org/10.1051/bioconf/20202700061.
20. Aierqing S., Nakagawa A., Bungo T. Association between temperament and polymorphisms of CRH and leptin in Japanese Black Cattle // Journal of advanced veterinary and animal research. 2020. V. 7. № 1. pp. 1-5. http://doi.org/10.5455/javar.2020.g386.
21. Взаимосвязь полиморфизм генов липидного обмена (LEP, TG5) с молочной продуктивностью крупного рогатого скота / Ф. Ф. Зиннатов, А. Р. Шамсова, Ф. Ф. Зиннатова и др. // Учёные записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины. 2017. Т. 231. С. 72-75.
22. Сафина Н. Ю. Характеристика биологической эффективности и полноценности молочной продуктивности голштинских коров-первотёлок с разными генотипами лептина (LEP) // Вестник Курской ГСХА. 2018. № 4. С. 131-133.
23. Разработка способа проведения ПЦР-ПДРФ на примере DGAT1-гена крупного рогатого скота / С. В. Тюлькин, Р. Р. Вафин, А. В. Муратова и др. // Фундаментальные исследования. 2015. № 2-17. С. 3773-3775.
24. Effect of leptin gene polymorphisms on growth, slaughter and meat quality traits of grazing Brangus steers / P. M. Corva, G. V. F. Macedo, L. A. Soria et al. // Genet. Mol. Res. 2009. V. 8. № 1. pp. 105-116. http://doi.org/10.4238/vol8-1gmr556.
25. Полиморфизм гена OLR1 в выборке быков-производителей Республики Татарстан / М. Ламара, Г. Х. Халилова, Р. У. Зарипов и др. // Материалы Казанского международного конгресса евразийской интеграции. Казань, 2022. С. 15-22.
26. Полиморфизм генов лептина и диацилглицерол-О-ацилтрансферазы у голштинизированных чёрно-пёстрых быков / М. Ламара, Л. Р. Загидуллин, Т. М. Ахметов и др. // Агробиотехнологии и цифровое земледелие. 2022. № 2 (2). С. 43-48. http://doi.org/10.12737/2782-490X-2022-46-54.
