г. Казань, Россия
Казань, Россия
Приводится оценка влияния опрыскивания растений биопрепаратами на суммарный микробиом семян нового урожая. Исследования проводились на трех сорта яровой пшеницы отечественной селекции – Йолдыз, Бурлак и Ульяновская-105. В качестве биологических препаратов использовались препараты на основе штаммов эндофитных бактерий выделенных из семян яровой пшеницы (Bacillus mojavensis PS17, Bacillus velezensis KS25) и ярового ячменя (Bacillus velezensis KS31, Bacillus subtilis KS38). Обработка посевов яровой пшеницы проводилась в фазу выхода в трубку с использованием нормы расхода биопрепарата 1,0 л/га. Оценку влияния обработок на грибной и бактериальный микробиом проводили с использованием методов количественной ПЦР с определением тотальной (суммарной) ДНК микроорганизмов на единицу веса семян. В большинстве случаев применение обработки эндофитными бактериями снижает величину тотальной ДНК микромицетов на семенах. Среди изучаемых изолятов особенно выделялся штамм Bacillus subtilis KS-38, который обеспечил значительное (в 7,7-11,1 раз) уменьшение данного показателя на всех сортах. На сорте Ульяновская 105, существенный эффект (снижение почти в 47 раз), оказало применение Bacillus mojavensis PS-17, а на сорте Бурлак – Bacillus velezensis KS-31. На сортах Йолдыз и Ульяновская 105 наиболее сильное снижение тотальной ДНК микромицетов отмечалось для эндофитов, полученных из семян яровой пшеницы (Bacillus mojavensis PS-17, Bacillus velezensis KS-25), а на сорте Бурлак – эндофитов из семян ярового ячменя (Bacillus velezensis KS-31 и Bacillus subtilis KS-38). Снижение суммарной ДНК микромицетов в опытах был обусловлен использованием изучаемых биопрепаратов и в меньшей степени сортовыми особенностями. Для бактериального микробиома проявились сильные отличия между сортами. Достоверный рост показателя тотальной ДНК бактерий на всех изучаемых сортах был у Bacillus mojavensis PS-17 и Bacillus velezensis KS-31. Наибольший вклад в изменчивость содержание суммарной ДНК бактерий в семенах оказал сорт (29,9%), а вклад биопрепаратов был ниже (25,5%). В опытах не было обнаружена корреляция между показателями тотальной ДНК микромицетов и бактерий в семенах яровой пшеницы.
микробиом, бактериальный микробиом, грибной микробиом, эндофитные бактерии, семена, сорта, яровая пшеница
Введение. Анализ существующих тенденций в развитии защиты сельскохозяйственных культур от фитопатогенов и абиотических стрессов позволяет сделать вывод о значительном увеличении значения биологических методов контроля [1, 2, 3]. В основе применения биопрепаратов в биологической защите растений лежит использование различных биологических агентов, представляющих собой различные микроорганизмы или их сочетание (консорциумы) [4]. Выделение и оценка эффективности различных микроорганизмов – потенциальных биоагентов биопрепаратов из различных природных источников, является одной из основных задач, стоящих перед сельскохозяйственной микробиологией и биотехнологией [5, 6].
К числу наиболее перспективных групп микроорганизмов, потенциальных биоагентов биопрепаратов, относятся эндофитные бактерии и грибы [7, 8]. Тесная связь между растением-хозяином и эндофитными микроорганизмами, обусловлена той ролью, которые они играют в различных биохимических и физиологических процессах растительного организма. В частности, установлено положительное влияние эндофитных бактерий на устойчивость растений к абиотическим стрессам и обеспеченность азотом [9], снижение развития инфекционных болезней [10, 11] и повышение урожайности сельскохозяйственных культур [12]. К числу наиболее широко применяемых биоагентов биопрепаратов относятся и бактерии рода Bacillus, обладающих широким спектром активности как в отношении подавления развития фитопатогенов, так и в стимулировании роста и развития различных культурных растений [13, 14, 15].
В последние годы, все большее распространение получила концепция «микробиома», представляющего собой сообщество микроорганизмов, тесно связанное с растением хозяином и оказывающее многостороннее влияние на его рост, развитие и иммунитет [16]. Одной из проблем при применении биопрепаратов становится оценка их влияния на микробиом растений и его различных органов. В частности, отмечено положительное влияние обработки клубней на почвенный микробиом растений картофеля [17]. Вместе с тем, недсотаточно изученным оказался вопрос влияния применения биопрепаратов в период вегетации на микробиом семян нового урожая, что и определило необходимость в соответствующих исследования.
Условия, материалы и методы. В качестве объекта исследований выступали сорта яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L) отечественной селекции – Йолдыз, Бурлак и Ульяновская 105. Сорта выращивались в 2022 году на опытных полях кафедры растениеводства и плодоовощеводства (руководитель проф. М.Ф. Амиров) Агробиотехнопарка Казанского ГАУ с использованием агротехнологий рекомендованных зональной системы земледелия. В фазу кущения проводилось опрыскивание растений биопрепаратами с нормой 1,0 л/га по следующей схеме: 1. Контроль – без обработки; 2. Bacillus mojavensis PS17; 3. Bacillus velezensis KS25; 4. Bacillus velezensis KS31. 5. Bacillus subtilis KS38. Эндофитные бактерии Bacillus mojavensis PS17 и Bacillus velezensis KS25 были выделены из семян пшеницы, а Bacillus velezensis KS31, Bacillus subtilis KS38 – из семян ярового ячменя. Через 2 месяца после уборки были отобраны пробы семян, полученные на каждом из изучаемых вариантов.
Выделение тотальной ДНК из растения. Для выделения тотальной ДНК, растительную биомассу перемалывали в жидком азоте с использованием фарфоровой ступки и пестика. Далее 100 мг измельченной биомассы поместили в пробирку, содержавшую 1 мл буфера [2% ЦTAБ, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1.4 M NaCl и 20 mМ ЭДТА]. Смесь инкубировали при температуре 60 °C в течение 1 часа и центрифугировали 5 мин при 10.000 об/мин. Отобранный супернатант помещали в новую стерильную пробирку, в которую дополнительно добавляли 0,7 объема фенола и 1,4 объема хлороформа. Для разделения фаз смесь тщательно перемешивали в течение 1 мин и центрифугировали в течение 5 мин при 13000 об/мин. Полученную водную фазу отобрали и поместили в новую стерильную пробирку. К водной фазе добавили 0,6 объема изопропилового спирта. После тщательного перемешивания (в течение 1 мин), ДНК осаждали центрифугированием при комнатной температуре в режиме 13000 об/мин в течение 5 мин. Осадки дважды промывали 70%-ным этанолом, затем однократно 96%-ным этанолом путем добавления, перемешивания и последующего центрифугирования при 10000 об/мин в течение 1 мин. Осадки высушивали в твердотельном термостате при температуре 55°C и растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера [10 mМ Трис-НCl, 1 mМ ЭДТА (pH 8.0)] при 60⁰С в течение 20 минут. Для дальнейшей очистки ДНК использовали набор cleanup mini DNA (Евроген, РФ) в соответствии с рекомендациями производителя.
Приготовление стандартных растворов ДНК для построения калибровочной кривой. Стандартные растворы ДНК для построения калибровочной кривой были приготовлены на основе чистого фрагмента бета-актина и вариабельного участка V4 гена 16S-рРНК, которые были амплифицированы из F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (Forl) ZUM2407 и B. mojavensis PS17, соответственно.
Для этого, суммарная ДНК F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici ZUM2407 и B. mojavensis PS17 была выделена вышеуказанным методом. Амплификацию ДНК проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержавшей 10 мкл 5X qPCRmix-HS (Евроген, РФ), 0,4 мкМ конечной концентрацией каждого праймера, 10 нг матричной ДНК и воды без нуклеаз. ПЦР амплификация была проведена с использованием прибора Thermal Cycler system (Bio-rad) со следующими условиями: начальная денатурация и активация ДНК-полимеразы при 95°С в течение 3мин, за которыми следовали 30 ПЦР-циклов включающих в себя этап денатурации по 10 сек при 95°С, отжига 30 сек при 55 °С для праймеров фрагмента гена бета-актина [В-аctF (5’-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3’)/В-аctR (5’-TACGAGTCCTTCTGGCCAT-3’)] или 58°С для праймеров участка V4 гена 16S-рРНК [U-F (5’- ACTCCTACGGGAGGAGCAGT-3’)/U-R (5’- GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’)], элонгации 30 сек при 72°С с окончательным удлинением при 72°С в течение 5 мин.
Визуализация амплифицированныx фрагментов проводилась в 1,25 % агарозном геле, содержавшем бромистый этидий (из расчета 5 мкл на 100 мл) в 1Х TBE буфере [890 мМ Трис-(гидроксиметил) аминометан, 890 mМ борная кислота, 20 mМ ЭДТА, pH 8.3]. После электрофореза фрагменты вырезали и очиcтили с помощью набора Cleanup mini DNA (Евроген, РФ) в соответствии с рекомендациями производителя.
Оценка обработок на сообщества грибов. Влияние обработок на растительное грибное сообщества оценивали путем количественной оценки общей грибковой ДНК с помощью количественной ПЦР. Бета-актин был использован в качестве таргетного гена. qPCR проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержавшей 5 мкл qPCRmix-HS SYBR (Евроген, РФ), 0,4 мкМ конечной концентрацией прямого и обратного В-аctF/ В-аctR, 10 нг матричной ДНК, и воду без нуклеаз. Амплификацию проводили с использованием прибора CFX96 Touch Real-Time PCR (Bio-rad, США) со следующими условиями: начальная денатурация и активация ДНК-полимеразы 95°С в течение 10 мин, за которыми следовали 40 ПЦР-циклов включающих в себя этап денатурации по 10 сек при 95°С, отжига праймеров фрагмента гена бета-актина 15 сек при 61 °С, элонгации 30 сек при 72°С с окончательным удлинением при 72 °С в течение 5 мин. Анализ кривой плавления строили при повышении температуры от 65°С до 95°С с регистрацией интенсивности флуоресценции с шагом 0,5°С (5 секунд на шаг). Стандартные кривые строили путем построения логарифмов значений шести последовательных десятичных разведений очищенного фрагмента ДНК гена бета-актина.
Влияние обработок на сообщества бактерии. Влияние обработок на бактериальное сообщества растений оценивали путем количественной оценки общей бактериальной ДНК с помощью количественной ПЦР. Вариабельный участок V4 гена 16S рРНК бактерии был использован в качестве таргетного гена. QPCR проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержавшей 5 мкл qPCRmix-HS SYBR (Евроген, РФ), 0,4 мкМ конечной концентрацией прямого и обратного U-F/ U-R, 10 нг матричной ДНК, и воду без нуклеаз. Амплификацию проводили с использованием прибора CFX96 Touch Real-Time PCR (Bio-rad, США) со следующими ПЦР-условиями: 95°С в течение 10 мин, за которой следовали 40 циклов включающих в себя этап денатурации по 10 сек при 95°С, отжига праймеров фрагмента гена бета-актина 15 сек при 58°С, элонгации 30 сек при 72°С с окончательным удлинением при 72°С в течение 5 мин. Анализ кривой плавления строили при повышении температуры от 65°С до 95°С с регистрацией интенсивности флуоресценции с шагом 0,5°С (5 секунд на шаг). Стандартные кривые строили путем построения логарифмов значений пяти последовательных десятичных разведений вариабельного участка V4 гена 16S рРНК.
Результаты и обсуждение. Результаты определения суммарной ДНК грибов в семенах различных сортов яровой пшеницы представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Содержание тотальной й ДНК микромицетов в семенах яровой пшеницы различных сортов (пг/нг тотальной ДНК), х 10-7 2022 г
|
Вариант |
Йолдыз |
Бурлак |
Ульяновская 105 |
|
38,8 ±1,01 |
28,9 ± 4,97 |
46,5 ± 3,52 |
|
|
Bacillus mojavensis PS-17 |
5,32 ± 0,42 |
25,6 ± 4,75 |
0,93 ± 0,06 |
|
Bacillus velezensis KS-25 |
7,23 ± 0,36 |
12,3 ± 4,99 |
2,56 ± 0,32 |
|
Bacillus velezensis KS-31 |
30,1 ± 2,13 |
2,04 ±0,12 |
21,2 ± 3,64 |
|
Bacillus subtilis KS-38 |
4,99 ±0,13 |
2,55 ± 0,27 |
5,3 ± 0,39 |
В результате исследований было установлено, что при применении эндофитных микроорганизмов при опрыскивании, в большинстве случаев отмечается снижение тотальной ДНК микромицетов на семенах, но степень такого воздействия различается между штаммами. Среди изучаемых изолятов особенно выделялся штамм Bacillus subtilis KS-38, который обеспечил значительное (в 7,7 -11,1 раз в зависимости от сорта) снижение данного показателя. Для других штаммов, на разных сортах эффект отличался. Так на сорте Ульяновская 105, существенный эффект (снижение почти в 47 раз), оказало применение Bacillus mojavensis PS-17, а на сорте Бурлак – Bacillus velezensis KS-31. При сравнении эффекта от применения штаммов с точки зрения их происхождения, то также отмечаются различия полученных результатов по сортам. Так, если на сортах Йолдыз и Ульяновская 105 наиболее сильное снижение тотальной ДНК микромицетов отмечалось для эндофитов, полученных из семян яровой пшеницы (Bacillus mojavensis PS-17, Bacillus velezensis KS-25), то на сорте Бурлак – для эндофитов из семян ярового ячменя (Bacillus velezensis KS-31 и Bacillus subtilis KS-38). С целью оценки вклада каждого из факторов (сорта, обработка растений) применяли дисперсионный анализ. Результаты оценки показали, что вклад сорта в изменчивость показателя составил менее 1%, а вклад биопрепаратов – 69,4%. Таким образом, снижение суммарной ДНК микромицетов в опытах был обусловлен использованием изучаемых биопрепаратов.
В таблице 2 представлены данные по оценке влияния применения биопрепаратов на бактериальный микробиом семян яровой пшеницы.
Таблица 2 – Содержание тотальной ДНК бактерий в семенах яровой пшеницы различных сортов (пг/нг тотальной ДНК), х 10-7 2022 г
|
Вариант |
Йолдыз |
Бурлак |
Ульяновская 105 |
|
Контроль |
19,82 ± 5,86 |
3,93 ± 0,94 |
4,11 ± 0,71 |
|
Bacillus mojavensis PS-17 |
38,43 ± 0,56 |
11,25 ± 3,15 |
6,29 ± 0,24 |
|
Bacillus velezensis KS-25 |
9,12 ± 1,21 |
3,94 ± 0,27* |
5,52 ± 0,86* |
|
Bacillus velezensis KS-31 |
47,31 ± 0,73 |
9,35 ± 2,36 |
17,64 ± 3,51 |
|
Bacillus subtilis KS-38 |
4,25 ± 0,27 |
2,47 ± 0,96* |
28,11 ± 4,10 |
Примечание: * – значения не достоверны в сравнении с контролем при Р=0,05.
В отличие от показателей для микромицетов, для бактериального микробиома проявились значительные отличия между сортами. Так в контроле для сорта Йолдыз показатель содержания ДНК бактерий на семенах был в 4,8-5,0 раз выше, чем у сортов Бурлак и Ульяновская 105. Между изучаемыми штаммами проявились отличия по влиянию на показатель в зависимости от сорта. Достоверный рост показателя на всех изучаемых сортах был у Bacillus mojavensis PS-17 и Bacillus velezensis KS-31. Для Bacillus velezensis KS-25 показатели были ниже или на уровне контроля, а для Bacillus subtilis KS-38 увеличение отмечалось только на сорте Ульяновская 105. Анализ результатов дисперсионного анализа показал, что наибольший вклад в изменчивость содержание суммарной ДНК бактерий в семенах оказал сорт (29,9%), а вклад биопрепаратов был ниже (25,5%). С точки зрения источников получения эндофитных бактерий, только на сорте Ульяновская 105 некоторое преимущество имели штаммы, выделенные из семян ярового ячменя.
Для оценки зависимости между значениями тотальной ДНК микромицетов и бактерий был проведен корреляционный анализ, который показал отсутствие тесной корреляции между ними (r= 0,13).
Выводы. Проведенные исследования показали, что опрыскивание растений яровой пшеницы различными биопрепаратами на основе эндофитных бактерий рода Bacillus оказывает различное влияние на грибной и бактериальный микробиом семян. Так, если в отношении микромицетов обработка снижает величину тотальной ДНК, независимо от сорта, то для бактериального микробиома, в первую очередь оказывает влияние сорт, а характер действия эндофитных бактерий определялся их видом. Увеличение суммарной ДНК бактерий на всех сортах происходило для Bacillus mojavensis PS-17 и Bacillus velezensis KS-31. Зависимость величины суммарной ДНК микромицетов и бактерий в семенах яровой пшеницы в опытах не обнаружена.
Работа выполнена в рамках реализации проекта «Генетическая технология селекции микроорганизмов и конструирования консорциумов на их основе для создания биопрепаратов в растениеводстве» (уникальный идентификатор контракта RF-1930.61321X0001).
1. Петухова М. С., Орлова Н. В. Приоритетные направления научно-технологического развития защиты сельскохозяйственных растений в России и мире // IACJ. 2021. №2.
2. Козлова Е.А. Биологизация систем защиты сельскохозяйственных культур от болезней // Вестник ОрелГАУ. 2022. №1 (94). С. 17-22.
3. The importance of natural factors in controlling the number density of pest pests / S. K.Yuldasheva, M. F. Bekchonova, D.A. Almatova, G. Askarova, K. Numonjon //International scientific journal of Biruni. 2022. №2. С. 114-120.
4. Комарова О. П., Козенко К. Ю., Земляницына С. В. Биологическая защита растений - одно из основных направлений снижения пестицидной нагрузки на агроценозы // МНИЖ. 2021. №9-1 (111). С. 98-102.
5. Перспективы использования псевдомонад, ассоциированных с почвенными люмбрицидами, против возбудителей корневых гнилей яровых зерновых / О. М. Минаева, Е. Е. Акимова, Н. Н. Терещенко, А. В. Кравец, Т. И. Зюбанова, М. В. Апенышева // Сельскохозяйственная биология. 2019. №1. С.91-100.
6. Терлецкий В. П. Молекулярно-генетическая идентификация штаммов бактерий-антагонистов фитопатогенов // Известия НВ АУК. 2022. №3 (67). С. 298-305.
7. Культивируемые эндофитные бактерии стеблей и листьев гороха посевного (Pisum sativum L.) / Е. Н. Васильева, Г. А. Ахтемова, А. М. Афонин, А. Ю. Борисов, И. А. Тихонович, В. А. Жуков // Экологическая генетика. 2020. №2. С.169-184.
8. Kuramshina Z. M., Smirnova Y. V., Khairullina R. M. Influence of bacillus subtilis and cadmium on the mycorrhization of wheat plants // МНИЖ. 2022. №4-2 (118). С.103-106.
9. Эффективность биопрепаратов эндофитных бактерий на яровой пшенице и устойчивость агроэкосистемы / А. А. Алферов, А. А. Завалин, Л. С. Чернова, В. К. Чеботарь // Плодородие. 2019. №1 (106). С. 41-44.
10. Латыпова Г. Ю., Черепанова Е. А., Максимов И. В. Вредоносность септориоза пшеницы и меры борьбы с ним // Вестник науки. 2019. №5 (14). С. 75-79.
11. Влияние бактерий-эндофитов озимых зерновых культур на развитие заболевания, вызываемого Microdochium nivale / О. А. Гоголева, А. Р. Мещеров, Е. А. Рязанов, Д. И. Мошенская, В. Ю. Горшков // БОНЦ УрО РАН. 2021. №3. С. 1.
12. Эндофитные микроорганизмы в фундаментальных исследованиях и сельском хозяйстве/ Е.Н. Васильева, Г.А. Ахтемова, В.А. Жуков, И.А. Тихонович // Экологическая генетика. 2019. №1. С. 19-32.
13. Ласточкина О.В. Адаптация и устойчивость растений пшеницы к засухе, опосредованная природными регуляторами роста Bacillus spp.: механизмы реализации и практическая значимость(обзор) // Сельскохозяйственная биология. 2021. №5. С. 843-867.
14. Сопрунова О. Б., Сопрунова В. Е., Байрамбеков Ш. Б., Полякова Е. В. Изучение влияния биопрепарата на основе Bacillus atrophaeus на урожайность картофеля // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Пищевые и биотехнологии. 2020. №4. С.86-95.
15. Арестова Н. О., Рябчун И. О. Возможность биологизации защиты виноградников от милдью с помощью биопрепарата // Вестник КрасГАУ. 2022. №11 (188). С.10-18.
16. Максимов И. В., Хайруллин Р. М. Фитоиммунитет и микробиом растений // Аграрная наука. 2019. №2. С.40-44.
17. Влияние бактерий рода Bacillus на почвенную микробиоту при предпосадочной обработке картофеля / В. С. Масленникова, В. П. Цветкова, С. М. Нерсесян, Е. В. Бедарева, И. М. Дубовский // Плодородие. 2022. №1 (124). С. 50-53.
