УДК 634 Садоводство в целом. Плодоводство
УДК 634.8 Виноградарство, виноградные лозы и виноградники
УДК 632.3 Бактериальные и вирусные болезни растений
Исследования проводили с целью привлечения особо ценных по хозяйственно-полезным признакам дикорастущих форм рода Vitis L. в селекцию как новых источников устойчивости к различным абиотическим и биотическим стресс-факторам. Работу выполняли на территории государственного природного заповедника «Утриш» Краснодарского края в 2020–2021 г. Форма (открытость), паутинистое опушение и степень антоциановой окраски верхушки молодого побега у исследуемых популяций дикорастущего винограда – одни из самых изменчивых морфологических признаков. Форма верхушки молодого побега варьирует от слегка открытой до полностью открытой. Паутинистое опушение коронки молодого побега у растений дикорастущего винограда изменяется от среднего (3 балла) до густого (4 балла). Обнаруженные и описанные дикорастущие формы винограда Ш1…Ш5 проходят все фазы развития в полной мере – от распускания почек до созревания ягод. В период проведения исследований образцы Ш1…Ш5 визуально не имели повреждений со стороны фитопатогенной микрофлоры. Это подтверждаю результаты лабораторных исследований. При проведении микробиологического анализа были обнаружены единичные сапрофитные бактерии. Колоний грибов и бактерий, схожих по фенотипу с патогенными, обнаружено не было. Определение наличия 7 экономически важных вирусных патогенов винограда показало, что образцы Ш1, Ш2, Ш3, Ш5 свободны от вирусных заболеваний. Только в образце Ш4 был обнаружен вирус GPGV (триховирус Grapevine Pinot gris virus).
дикорастущая форма, виноград, экология, биоразнообразие, популяция, фенотипический признак, морфологическая изменчивость.
Введение. С каждым годом растет интерес к изучению биологического разнообразия семейства Vitaceae Juss. Появляются новые данные о пополняющемся генетическом фонде как культурного винограда Vitis vinifera L., так и его дикорастущих форм [1, 2].
У рода Виноград (Vitis L.) насчитывается порядка семидесяти видов растений, произрастающих в условиях умеренного климата в Северном полушарии [3]. Так называемый лесной виноград (Vitis sylvestris) и его формы представляют собой лианы, чаще всего как одиноко растущие растения или популяции [4].
Согласно систематике, на основании разнообразия морфологических особенностей его подразделяют на несколько подвидов [5, 6]. Аборигенные и дикорастущие формы винограда различного эколого-географического происхождения – ценный селекционно-генетический материал. Комплексные исследования (в том числе молекулярно-генетические) позволяют в полной мере разобраться в вопросе происхождения винограда и выявления наиболее сходных или сильно расхожих его генотипов. В литературе есть информация по происхождению крымских, дагестанских, донских и иных аборигенных видов винограда [6, 7, 8]. При этом кубанские дикоросы и автохтоны слабо изучены. Между тем ареал их распространения довольно широк. Дикорастущий виноград, как это научно доказано, обладает повышенной устойчивостью к морозу, засухе, засолению почв, вредителям и болезням, что важно для селекции виноградной культуры [9, 10].
Один из первых этапов при определении перспективных для селекционного процесса форм – оценка на устойчивость к экономически важным патогенам. Ранее в ходе морфо-биологического изучения популяций диких форм винограда, произрастающих на территории заповедника Утриш, симптомов поражения фитопатогенами не наблюдали [11].
На сегодняшний день, как в России, так и в мире в целом, наблюдаются тенденции экологизации винодельческой отрасли, преобладания методов селекции вместо химических методов борьбы с различными фитопатогенными организмами [12]. Для создания нового сорта винограда необходимо провести колоссальнейшую работу. При этом важно использовать источники устойчивости к различным изменениям климата, фитопатогенам и вредителям. Такими источниками могут служить, как генотипы культивируемого винограда, так и его дикорастущие формы.
В силу малоизученности дикорастущего винограда и его ценных качеств, проводятся исследования дикоросов Кубани на лесной территории заповедника «Утриш», в частности, в урочище Широкая щель Навагирского хребта [13].
Цель исследований – выявление источников устойчивости к биотическим и абиотическим стресс-факторам для пополнения генофонда винограда и вовлечения их в селекционный процесс.
Условия, материалы и методы. Учет и оценку морфо-биологических признаков дикорастущего винограда проводили в полевых условиях в 2020–2021 гг.
Природный заповедник «Утриш» расположен в зоне средиземноморского климата с воздействием умеренного [14]. В январе средняя тем-ра – 2,5℃, в июле – 23,4℃. Среднегодовая температура – 12,0℃. Среднегодовая сумма осадков – 570-700 мм.
Метеоусловия 2020 г. были нестабильными. Наблюдали резкие скачки температурного режима в зимне-весенние месяцы и неравномерное выпадение осадков, синхронно влекущих за собой относительную влажность воздуха, в весенне-летние. Годовая среднесуточная температура воздуха составила 13,8 °С, в период активной вегетации (с мая по сентябрь) она была равна 21,5 °С, максимальная достигала 32,2 °С. Общая сумма осадков за вегетационный период – 192,8 мм. Наиболее холодный зимний месяц – январь, температура в третьей декаде месяца составляла 2,4 °С. Сумма положительных температур за февраль была равна 15,2 °С, что на 3,7 °С больше января. Весенний период отличился возвратными заморозками до -6,5 °С во второй декаде марта и до -8 °С во второй декаде апреле. В начале цветения винограда (начало июня) наблюдалось выпадение осадков в норме (11,9 мм). При созревании урожая была засуха (всего 2,0 мм осадков в июле и августе. Температура среднесуточная в этот период составляла 24,5℃, влажность – 54% (что ниже нормы для нормального созревания ягод). Сумма активных температур за вегетационный период составила 3839,5 °С.
Метеорологические условия 2021 г. характеризовались нестабильной погодой с частыми аномальными явлениями в форме низкотемпературных и водных стрессов, повышенной инсоляции и дефицита атмосферных осадков. По данным метеостанции района исследований среднегодовая температура воздуха составила 13,8 ºС, в период интенсивной вегетации (май–сентябрь) – 20,5 ºС. Сумма активных температур – 3323,6 ºС. Самый теплый месяц – июль (25,4 ºС), самый холодный – февраль (3,0 ºС), при этом критически низкой температурой характеризовался январь – -15,1 ºС мороза. Абсолютный максимум температуры воздуха 35,7 ºС отмечали в июле и августе. Среднегодовое количество атмосферных осадков составило 745 мм, из которых 203,4 мм выпало за 2 декаду августа, всего за период активного роста (май–сентябрь) – 558,4 мм. Среднее значение ГТК за вегетационный период 2021 г. составил 1,05.
При проведении исследований применяли следующие методы:
маршрутно-рекогносцировочный (территория парка условно разделена на маршруты, при прохождении которых составляли флористические описания; геоботанический [15] (описание рельефа, структура фитоценоза, а также подробная характеристика растительности по определенной геоботанической форме;
морфометрический (оценивали морфометрические показатели вегетативной и генеративной части дикорастущих форм с использованием ампелографических описаний) [16].
Пробы для дальнейшей идентификации фитопатогенов (живые части растений – листья, верхушки молодых побегов) отбирали в июне в фазе роста побегов после цветения со внешне здоровых растений в количестве 300…500 г зеленой массы в трехкратной повторности. Для определения наличия патогенных бактерий фрагменты листьев и лозы поверхностно стерилизовали в растворе перманганата калия в течение 30 с, промывали стерильной дистиллированной водой и помещали в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5…2,0 мл с добавлением 500 мкл стерильной воды. После стерилизации препаровальной иглой наносили повреждения, нарушая целостность ткани. Суспензию оставляли на 40…60 минут в ламинаром боксе, после чего шпателем высевали по 50 мкл на диагностическую среду King B [17]. Высеянные бактерии инкубировали в течение 24…48 ч в термостате при температуре 28 °С.
Определение 7 экономически значимых вирусных патогенов винограда (GPGV, GFkV, GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3, GVA, GFLV) проводили с методом ОТ-ПЦР [12]. Тотальную РНК из фрагментов листьев и лозы выделяли по методике с использованием частиц кремния [17, 18, 19]. Качество выделения РНК проверяли путем электрофоретического анализа в 1 %-ном агарозном геле. Для синтеза кДНК использовали 2 мкл выделенной РНК со случайными гексамерами в качестве праймера и обратную транскриптазу RevertAid H Minus в соответствии с протоколом производителя (Thermo Fisher Scientific). Далее 1 мкл кДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР в реакционной смеси, содержащей также буфер для Taq полимеразы, 0,2 мМ dNTP, 1 мкМ прямого и обратного праймеров, специфичных к последовательности геномов детектируемых вирусов [19, 20], 2,5 мМ MgCl2, 0,375 ед. Taq полимеразы. В качестве контроля использовали образцы кДНК, в которых ранее были обнаружены изучаемые вирусы. ПЦР-продукты визуализировали путем электрофореза в 1 %-ном агарозном геле с маркером длин ДНК «100+ bp DNA Ladder» (каталожный номер NL002, ЗАО Евроген). Положительным результатом считали наличие ПЦР-продукта ожидаемого размера.
Результаты и обсуждение. В 2020–2021 г. обнаружены новые места произрастания дикоросов винограда на территории государственного заповедника «Утриш», а именно, в урочище Широкая щель. Рельеф – низкогорный с высотой над уровнем моря 50-70 м. Почвы карбонатные коричневые каменистые. Растительный пояс – мезофильные широколиственные леса с преобладанием Quercus pubescens Willd., Fraxinus excelsior L., Carpinus orientalis Mill., Juniperus foetidissima Willd. и др.
В урочище обнаружено и исследовано 5 экземпляров дикорастущего винограда, произрастающих один от другого на расстоянии 600…1200 м вдоль лесного ручья. Листья у них 5-и лопастные (редко встречаются 3-х), с ярко выраженными лопастями, глубокими вырезками и опушением.
За 2020–2021 гг. исследовано порядка сорока морфо-признаков дикорастущих форм винограда. В среднем за два года среди растений винограда из урочища Широкая щель отмечена различия в основном по форме листа и глубине верхних боковых вырезок листа. Вариаций по годам не наблюдали (табл. 1).
Таблица 1 – Морфологические особенности дикорастущих форм винограда (среднее за 2020–2021 гг.)
|
Признак |
Номер популяции |
||||
|
|
Ш1 |
Ш2 |
Ш3 |
Ш4 |
Ш5 |
|
Форма верхушки молодого побега |
слегка открытая |
открытая наполовину |
слегка открытая |
открытая наполовину |
слегка открытая |
|
Паутинистое опушение верхушки молодого побега |
густое |
среднее |
густое |
среднее |
густое |
|
Антоциановая окраска верхушки молодого побега |
слабая |
слабая |
слабая |
средняя |
слабая |
|
Щетинистое опушение жилок нижней стороны листа |
редкое |
среднее |
редкое |
среднее |
редкое |
|
Форма листа |
пяти угольная |
округлая |
округлая |
дельтовидная |
пятиуголь-ная |
|
Глубина верхних боковых вырезок листа |
глубокие |
очень глубокие |
очень глубокие |
средние |
глубокие |
|
Степень открытости черешковой выемки листа |
закрытые |
закрытые |
закрытые |
открытые |
открытые |
|
Форма зубчиков листа |
прямо-выпуклые |
прямо-выпуклые |
прямо-выпуклые |
выпуклые |
выпуклые |
|
Паутинистое опушение нижней стороны листа |
среднее |
среднее |
среднее |
густое |
густое |
|
Тип цветка |
-* |
- |
женский |
женский |
мужской |
|
Окраска ягоды (без налета) |
- |
- |
черная |
черная |
- |
|
Антоциановая окраска мякоти ягоды |
- |
- |
средняя |
слабая |
- |
*нет данных.
Исследуемые растения дикорастущего винограда двудомные. Найдены экземпляры с женскими (Ш3, Ш4) и мужскими цветками (Ш5) (рис. 1, 2).
а)
Рисунок 1 – Цветки различного типа в урочище Широкая щель заповедника «Утриш» (2021 г.): а) женский тип цветка в популяции №3 (Ш3); б) мужской тип цветка в популяции №5 (Ш5).
Опираясь на методику [15], степень открытости коронки молодого побега у растений урочища Широкая щель изменялась от слегка открытой до открытой. Паутинистое опушение – от среднего (3 балла) до густого (4 балла).
Обнаруженные и описанные дикорастущие формы винограда Ш1…Ш5 проходили все фазы развития в оба года в полной мере – от распускания почек до созревания винограда. В результате микробиологического анализа были обнаружены единичные сапрофитные бактерии. Колоний грибов и бактерий, схожих по фенотипу с патогенными, не обнаружено. Образцы Ш1, Ш2, Ш3, Ш5 свободны от 7 экономически значимых вирусных патогенов винограда (табл. 2). По результатам исследований только в образце Ш4 присутствовал вирус GPGV (триховирус Grapevine Pinot gris virus).
Таблица 2 – Результаты детекции в образцах дикорастущих форм винограда
|
ПЦР на 18S |
GPGV |
GFkV |
GLRaV-1 |
GLRaV-2 |
GLRaV-3 |
GVA |
GFLV |
|
|
Ш1 |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
Ш2 |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
Ш3 |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
Ш4 |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
Ш5 |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Выводы. В среднем за два года среди растений винограда урочища Широкая щель сильно изменчивыми были такие признаки, как форма листа и паутинистое опушение нижней стороны листа, форма верхушки молодого побега, степень антоциановой окраски и опушение коронки побега и др. Выявлены дикорастущие формы винограда (Ш1, Ш2, Ш3, Ш5), свободные от 7 экономически важных вирусных патогенов винограда (GPGV, GFkV, GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3, GVA, GFLV), перспективные для искусственной инокуляции различными патогенами с целью изучения устойчивости к ним и включения в селекционный процесс.
1. Olmo H. P. The origin and domestication of vinifera grape // The origin and ancient history of wine. Luxembourg: Gordon and Breach, 1995. Р. 31-43.
2. Ampelometric Leaf Trait and SSR Loci Selection for a Multivariate Statistical Approach in Vitis vinifera L. Biodiversity Management / V. Alba, C. Bergamini, R. Genghi, et al. // Mol Biotechnol. 2017. No. 57. P. 514-520.
3. Saniya K. J., Naruka I. S., Singh P. P. Genetic variability and association among colour and white seedless genotypes of grape (Vitis vinifera) // Indian Journal of Agricultural Sciences. 2018. Vol. 88. No. 5. P. 737-745.
4. Identification of downy mildew resistance genes Rpv10 and Rpv3 by DNA-marker analysis in a Russian grapevine germplasm collection / E. T. Ilnitskaya, S. V. Tokmakov, M. V. Makarkina, et al. // Acta Horticulturae. 2019. Vol. 1248. P. 129-134.
5. Genetic diversity assessment of crimean wild grape forms based on microsatellites polymorphism / S. М. Gorislavets, V. А. Volodin, Ya. A. Volkov, et al. // Acta Horticulturae. 2021. Vol. 1324. P. 305-313.
6. Аджиев А. М., Зармаев А. А., Аджиева С. А. Дагестан - исторический центр естественного формообразования винограда // Виноделие и виноградарство. 2015. №6. С. 36-39.
7. Ганич В. А., Наумова Л. Г., Матвеева Н. В. Сортоизучение малораспространенных аборигенных донских сортов винограда // Вестник КрасГАУ. 2022. № 4 (181). С. 24-30.
8. An evolutionary ecology perspective to address forest pathology challenges of today and tomorrow / M. L. Desprez-Loustau, J. Aguayo, C. Dutech, et al. // Annals of Forest Science. 2016. No. 73. P. 45-67.
9. Ampelographic and genetic characterization of Croatian grapevine varieties / E. Maletic, I. Pejic, J. Karoglan Kontic, et al. // Vitis - Journal of Grapevine Research. 2018. No. 54. P. 93-98.
10. The Kuban grapes wild forms growing on the Red forest nature reserve territory / I. V. Gorbunov, E. T. Ilnitskaya, A. A. Lukyanov, et al. // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. Krasnoyarsk Science and Technology City Hall. Krasnoyarsk, Russian Federation, 2021. URL: https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1755-1315/677/4/042072 (дата обращения 10.06.2022). doi:https://doi.org/10.1088/1755-1315/677/4/042072
11. Методы полевых экологических исследований: учеб. пособие / О. Н. Артаев, Д. И. Башмаков, О. В. Безина и др. Саранск: Изд-во Мордовского ун-та, 2014. 412 с.
12. Porotikova, E.; Terehova, U.; Volodin, V.; Yurchenko, E.; Vinogradova, S. Distribution and Genetic Diversity of Grapevine Viruses in Russia // Plants. 2021. Vol. 10 No. 1080. URL: https://www.mdpi.com/2223-7747/10/6/1080 (date of application 1.06.2022). doi:https://doi.org/10.3390/plants10061080.
13. Горбунов И. В., Лукьянов А. А., Михайловский С. С. Эколого-биологические характеристики некоторых местопроизрастаний дикорастущих форм винограда Кубани // Вестник КрасГАУ. 2022. № 7(184). С. 36-45.
14. Ткаченко Ю. Ю., Денисов В. И. Особенности климата прибрежной зоны Северо-Восточной части Чёрного моря. Ростов н/Д.: ЮФУ, 2015. 79 с.
15. Schaad, N. W. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria / N.W Schaad, J.B. Jones, W. Chum. USA, St. Paul, MN.: 3rd Ed. APS Press, 2001. 372 p.
16. Лазаревский М. А. Изучение сортов винограда. Ростов н/Д: Изд-во Рост. ун-та, 1963. 151 с.
17. Распространение вирусов скручивания листьев винограда 1 и 3 (grapevine leafroll-associated viruses-1 и -3) на территории Крыма / Е. В. Поротикова, В. И. Рисованная, Я. А. Волков и др. // Вестник Московского университета. Серия 16: Биология. 2016. № 2. С.13 16.
18. A new TaqMan method for the identification of phytoplasmas associated with grapevine yellows by real-time PCR assay / E. Angelini, G. L. Bianchi, L. Filippin, et al. // J. Microbiol. Methods. 2007. Vol. 68. No. 3. P. 613-622.
19. Occurrence of Grapevine Pinot gris virus in Friuli Venezia Giulia (Italy): field monitoring and virus quantification by real-time RT-PCR / G. L. Bianchi, F. De Amicis, L. De Sabbata et al. // EPPO Bull. 2015. Vol. 45. No. 1. P. 22-32.
20. Grapevine Viruses: Molecular Biology, Diagnostics and Management / edited by B. Meng, G. P. Martelli, D. A. Golino, et al. Switzerland: Springer Cham, 2017. URL: https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-319-57706-7?error=cookies_not_supported&code=210b0466-c77f-40fc-86f9-f0a6431c2373#bibliographic-information (дата обращения: 10.06.2022).
