Москва, г. Москва и Московская область, Россия
аспирант
Россия
ГРНТИ 68.41 Ветеринария
Цель исследований – выявить особенности заживления ахиллова сухожилия в условиях ауто-трансплантации клеточного продукта, отражающие регенераторную активность стромально-васкулярной фракции. Современные регенеративные методы лечения животных с повреждениями сухо-жилий предполагают применение стромально-васкулярных клеток жировой ткани. Они представляют популяцию клеток, обладающих высокой степенью пластичности, пролиферативной активностью и способностью к секреции множества ангиогенных факторов. Однако отсутствуют данные о морфоло-гических и морфометрических эквивалентах регенераторного процесса при их применении в условиях повреждения сухожильно-связочного аппарата. Представлены микроморфометрические показатели, обосновывающие эффективность применения аутологичного клеточного продукта при разрыве ахил-лова сухожилия. Проведена оценка влияния стромально-васкулярной фракции из жировой ткани крыс на регенеративные процессы при заживлении индуцированного дефекта сухожильной ткани, выражающи-еся в увеличении у подобных животных показателей толщины пучков первого и второго порядка в под-опытной группе, достоверных различиях по сравнению с контролем клеток фибробластической попу-ляции и количестве кровеносных капилляров. На основании данных о положительном влиянии исследуе-мого аутологичного клеточного продукта на регенерацию ахиллова сухожилия научно обоснована целе-сообразность его применения в ветеринарной медицине. Экспериментальная модель исследования – декоративная крыса (n=20). Материал исследований – ахиллово сухожилие. Использовали комплексный методический подход, включающий экспериментальное моделирование, микроморфологические иссле-дования, микроморфометрию и статистическую обработку данных. Выявлено, что у подопытных жи-вотных, которым вводили стромально-васкулярную фракцию, обнаружены микроморфометрические преобразования соединительной ткани, направленные на утолщение пучков первого и второго поряд-ков, переход фибробластов в структурированные и упорядоченные фиброциты (теноциты), ускорение коллагеногенеза и усиление васкуляризации.
сухожилие, волокна, фракция, регенерация, васкуляризация, фиброциты
Изучение восстановительных потенций тканей опорно-двигательного аппарата и путей направленного воздействия на ускорение репаративных процессов – одна из фундаментальных проблем ветеринарной травматологии и ортопедии [6, 7].
Стремительное развитие науки в области регенеративной медицины и клеточной биологии, фундаментальные исследования и поиск перспективных терапевтических подходов в данном направлении обещают в ближайшем будущем новые открытия. Высокий интерес к технологиям применения различных стволовых клеток во многом определен их потенциалом в восстановлении поврежденных тканей и органов [1, 3].
Суть применения таких технологий заключается в стимуляции восстановления поврежденных сухожилий с помощью клеток, взятых из организма самого объекта. Аутологичные клетки не отторгаются организмом животного после введения, поскольку распознаются его защитными системами как собственные [2, 3].
Современные регенеративные методы лечения животных с повреждениями сухожилий предполагают применение стромально-васкулярных клеток жировой ткани. Известно, что они представляют популяцию клеток, обладающих высокой степенью пластичности, пролиферативной активностью и способностью к секреции множества ангиогенных факторов [4, 5, 7]. Вместе с тем, отсутствуют данные о морфологических и морфометрических эквивалентах регенераторного процесса при их применении в условиях повреждения сухожильно-связочного аппарата.
Цель исследований – выявить особенности заживления ахиллова сухожилия в условиях аутотрансплантации клеточного продукта, отражающие регенераторную активность стромально-васкулярной фракции.
Задачи исследований – установить сравнительные микроморфометрические показатели пучков коллагеновых волокон ткани сухожилия 1 и 2 порядка в области травмы у животных экспериментальных групп (интактная, контрольная и подопытная); представить микроморфометрические показатели фибробластической популяции в сравниваемых группах; охарактеризовать степень васкуляризации ткани регенерата в зоне повреждения.
Материал и методы исследования. Исследования выполнены на базе кафедры «Анатомия и гистология животных им. профессора А. Ф. Климова» ФГБОУ ВО МГАВМиБ — МВА имени К. И. Скрябина на трех группах декоративных крыс разновидности «Стандарт» (интактная, контрольная и подопытная), подобранных по принципу аналогов.
Экспериментальные группы были сформированы из клинически здоровых животных с учетом происхождения, пола (самцы), возраста, живой массы.
Использовали комплексный методический подход, включающий экспериментальное
моделирование с целью получения аутологичного клеточного продукта, анатомическое препарирование, гистологическое исследование биоптатов ахиллова сухожилия, микроморфологические исследования, микроморфометрию и статистическую обработку данных. В контрольной группе область повреждения заживала самопроизвольно, в подопытной группе – под влиянием аутологичных клеток стромально-васкулярной фракции. Ахиллово сухожилие животных интактной группы использовали для определения нормативных микроморфометрических показателей.
Все манипуляции с лабораторными животными проводили согласно «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18 марта 1986 г. ETS №123) после выдерживания их на двухнедельном карантине.
Изучение общей микроморфологической картины проводили при помощи светового микроскопа «Nikon» (Япония) после окраски гистологических срезов гематоксилином и эозином по Ван-Гизону по общепринятым методикам.
Микроморфометрию осуществляли с помощью программы «ImagScope». Оценку статистической значимости различий исследуемых показателей осуществляли с использованием критерия Стьюдента.
Результаты исследований. Как известно, ткань сухожилия относится к группе соединительных тканей, являясь плотной оформленной соединительной тканью. У крыс ее строение подчинено общим закономерностям, которые присущи животным других таксономических групп. Установлено, что функциональной единицей ткани является участок межклеточного вещества с сухожильными клетками, который окружен артериоло-венулярным анастомозом. Каждая функциональная единица характеризуется четкой цито-, фибро- и ангиоархитектоникой. Коллагеновые волокна окружены эндотеноном, вдоль которого располагаются цепочки клеток фибробластической популяции и сосуды капиллярного русла.
На основании данных сравнительного микроморфометрического анализа регенерата в исследуемых группах установлено, что на 7 сутки у особей контрольной группы пучки коллагеновых волокон первого порядка тонкие, не имеют строгой ориентационной упорядоченности и четких границ, в отличие от пучков первого порядка у крыс подопытной группы, которые по параметрам толщины коллагеновых конструкций опережали группу контроля. На 14 сутки наблюдений тенденция к увеличению толщины пучков сохранялась с преимуществом у подопытной группы. К 30 суткам эксперимента у крыс подопытной группы толщина пучков первого порядка существенно возрастала по сравнению с предыдущим сроком наблюдений. Следует отметить, что сами волокна приобретают волнистую конфигурацию, свойственную морфологической организации сухожилия в норме. На заключительном сроке эксперимента выявлены достоверные различия в показателях толщины пучков первого порядка у животных сравниваемых групп. Более того, морфометрические показатели сухожильной ткани у животных подопытной группы на 60 сутки практически соответствовали параметрам нормы (параметрам интактной группы) (табл. 1).
Таблица 1
Микроморфометрические показатели пучков первого порядка ахиллова сухожилия крыс
в контрольной, подопытной и интактной группах, мкм (Р≤0,05)
|
Сроки эксперимента |
Группа животных |
||
|
I группа (контроль) |
II группа (подопытная) |
III группа (интактная) |
|
|
7 сутки |
3,34±0,79 |
3,78±0,92 |
8,35±1,02 |
|
14 сутки |
3,55±0,79 |
4,86±0,45 |
|
|
30 сутки |
4,71±0,69 |
6,14±0,79 |
|
|
60 сутки |
4,76±0,50 |
6,42±0,67 |
|
При изучении микроморфометрических показателей на 14 сутки эксперимента было установлено, что на данном сроке регенеративного процесса в ткани сухожилия формируются хорошо различимые пучки второго порядка. Представители подопытной группы достоверно опережают по их толщине своих контрольных аналогов. Этот процесс усиливается к 30 суткам эксперимента. На заключительном сроке эксперимента (60 сутки) показатель толщины волокон в подопытной группе становится равен 40,1±6,8 мкм, что соответствует состоянию сухожильной ткани в норме (показатель толщины составляет 43,0±4,85 мкм) (табл. 2).
Таблица 2
Микроморфометрические показатели пучков второго порядка ахиллова сухожилия крыс
в контрольной, подопытной и интактной группах, мкм (Р≤0,05)
|
Сроки эксперимента |
Группа животных |
||
|
I группа (контроль) |
II группа (подопытная |
III группа (интактная) |
|
|
14 сутки |
17,6±2,37 |
23,2±3,41 |
43,0±4,85 |
|
30 сутки |
25,3±6,94 |
30,2±3,58 |
|
|
60 сутки |
33,4±7,11 |
40,1±6,8 |
|
При сравнительном анализе цитоархитектоники, и прежде всего клеток фибробластической популяции, выявлено, что на ранних сроках регенерации они многочисленны, так как способствуют формированию новой сухожильной ткани в зоне дефекта и тем самым активно задействованы в процессе коллагеногенеза. Вместе с тем, в подопытной группе обнаружено их достоверное, по сравнению с контролем, количественное уменьшение, в связи с приобретением фенотипа фиброцитов, что может отражать стадийность ремоделирования цитоархитектоники, которое начинается со стороны эндотенона (табл. 3).
Таблица 3
Количество фибробластов в зоне повреждения ахиллова сухожилия крыс
в контрольной, подопытной и интактной группах, шт.
|
Сроки эксперимента |
Группа животных |
||
|
I группа (контроль) |
II группа (подопытная) |
III группа (интактная) |
|
|
7 сутки |
121 |
102 |
36 |
|
14 сутки |
98 |
77 |
|
|
30 сутки |
74 |
61 |
|
|
60 сутки |
59 |
48 |
|
Одним из важных критериев полноценной регенерации сухожильной ткани является степень ее васкуляризации. При микроморфометрических исследованиях кровеносного русла ткани регенерата существенных различий между показателями их количества в сравниваемых группах не обнаружено. Вместе с тем, на 30 сутки наблюдений у животных в подопытной группе насыщенность ткани сухожилия капиллярами превосходит таковую в контроле. Из этого следует, что стромально-васкулярная фракция существенное влияние на развитие капиллярной сети в области дефекта оказывает на 30 сутки эксперимента (табл. 4).
Таблица 4
Количество кровеносных капилляров в зоне повреждения ахиллова сухожилия крыс
в контрольной, подопытной и интактной группах, шт.
|
Сроки эксперимента |
Группа животных |
||
|
I группа (контроль) |
II группа (подопытная) |
III группа (интактная) |
|
|
7 сутки |
3 |
5 |
6 |
|
14 сутки |
5 |
6 |
|
|
30 сутки |
4 |
8 |
|
|
60 сутки |
4 |
6 |
|
Заключение. Установлены особенности репаративной регенерации при индуцированном повреждении ахиллова сухожилия в условиях трансплантации аутологичного клеточного продукта – стромально-васкулярной фракции, выражающиеся в формировании в области повреждения органоспецифического регенерата и сокращений общих сроков заживления. Механизм ускоренной, в сравнении с контролем, регенерации травмированного сухожилия при аутотрансплантации тестируемого клеточного продукта связан со стимуляцией в области регенерата коллагено- и ангиогенеза, что коррелирует с установленными микроморфометрическими показателями. Установленные микроморфометрические показатели регенерата в области индуцированной травмы ахиллова сухожилия, направленные на стимуляцию и трофическое обеспечение регенераторного процесса, свидетельствуют о перспективности применения аутологичной стромально-васкулярной фракции в клинической практике при заживлении травм сухожилий у животных.
1. Берсенев, А. В. Клеточная трансплантология - история, современное состояние и перспективы / А. В. Берсенев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2005. - №1. - С. 32-33.
2. Веремеев, А. В. Cтромально-васкулярная фракция жировой ткани как альтернативный источник кле-точного материала для регенеративной медицины / А. В. Веремеев, Р. Н. Болгарин, М. А. Петкова, Н. Кац, В. Г. Нестеренко // Гены & клетки. - 2016. - Т. XI, №1. - С. 35-42.
3. Деев, Р. В. Профессор Александр Александрович Максимов: эволюция идей / Р. В. Деев // Гены & клет-ки. - 2014. - Т. IX, № 2. - С. 2-14.
4. Иванов, А. В. Современные представления о механизмах репаративной регенерации ахиллова сухо-жилия после его разрыва / А. В. Иванов, Д. В. Козлов // Вестник Смоленской государственной медицинской академии - 2015. - №4 - С. 74-79.
5. Ярыгин, В. Н. Тканевые клеточные системы - основа биомедицинских клеточных технологий нового поколения: контуры идеологии / В. Н. Ярыгин // Вестник РАМН. - 2004. - №9. - С. 12-19.
6. Glazebrook, M. A. Histological Analysis of Achilles Tendons in an Overuse Rat Model / M. A. Glazebrook, J. R. Wright, Jr. M. Langman, D. W. Stanish, J. M. Lee // Journal of orthopaedic research. - 2008. - P. 840-846.
7. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy / R. K. Smith // Disabil Rehabil. - 2008. - №30. - P.1752-1758.
