ИССЛЕДОВАНИЕ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ, ОБЛАДАЮЩИХ Β-ГАЛАКТОЗИДАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ИХ АНАЛИЗ
Аннотация и ключевые слова
Аннотация (русский):
Лактаза (β-галактозидаза) – фермент класса гидролаз, катализирующий расщепление лактозы в желу-дочно-кишечном тракте на галактозу и лактулозу. В нашей стране производство низколактозных молочных продуктов и лекарственных средств для восполнения дефицита лактозы отсутствует. Получение их является перспективным направлением. В связи с этим проведен анализ микроорганизмов-продуцентов фермента β-галактозидазы, сделан вывод по полученным результатам, которые будут использованы в дальнейших исследованиях.

Ключевые слова:
Лактаза, препараты β-галактозидазы, биосинтез, дрожжи.
Текст
Текст произведения (PDF): Читать Скачать

 

Введение

Препараты β-галактозидазы прежде всего находят широкое применение в молочной промышленности и в тех отраслях, где возможно использование отходов молокоперерабатывающей промышленности, содержащих дисахарид лактозу. Лактоза является очень ценным углеводом, но сахар этот плохорастворим, несладкий, не усваивается часто животными организмами, не сбраживается дрожжами. Если с помощью β-галактозидазы осуществить его расщепление до галактозы и глюкозы, то эта смесь уже имеет сладкий вкус, хорошо растворяется в воде, глюкоза усваивается как животными, так и микроорганизмами. Обработка молока и молочных изделий препаратами β-галактозидазы позволяет обеспечить часть населения, страдающего лактазной недостаточностью, молочными продуктами, почти не содержащими лактозу [2].

Обработка молока ферментом при концентрировании, особенно при его последующем хранении при низких температурах, позволяет повысить стабильность продукта при регенерации. Гидролиз около 20–30 % лактозы молока при приготовлении мороженого позволяет предотвратить явление его кристаллизации и уменьшить на 1–2 % добавку сахарозы. Использование β-галактозидазы при приготовлении кисломолочных продуктов способствует более быстрому развитию молочнокислых микроорганизмов, что позволяет ускорить технологические процессы [3].

5

Использование β-галактозидазы делает перспективным утилизацию различных молочных отходов, особенно молочной сыворотки, во многих отраслях, например в хлебопечении, в кондитерской промышленности, при производстве мороженого, в качестве компонента питательных сред при получении белковых обогатителей кормов или различных биологически активных веществ, в кормопроизводстве, в медицинской промышленности, медицине и других областях. Большое значение придается β-галактозидазе при ее использовании в аналитических целях и для диагностики ряда заболеваний [1].

 

Непереносимость молока встречается у 15–30 % населения России и обусловлена дефицитом в организме человека фермента лактазы, который вырабатывается в тонком кишечнике и катализирует расщепление лактозы (молочного сахара) на глюкозу и галактозу, которые затем легко всасываются в кровь.

Коррекция лактазной недостаточности может быть осуществлена двумя путями: использованием молочных продуктов с частично гидролизованной лактозой либо приемом лекарственных препаратов, содержащих фермент лактазу.

В нашей стране производство низколактозных молочных продуктов и лекарственных средств для восполнения дефицита лактозы отсутствует. Импортные препараты, закупаемые в ограниченном количестве, не удовлетворяют спрос в нужном объеме. В связи с этим создание конкурентоспособного отечественного универсального препарата β-галак-тозидазы, который может быть использован как для предварительного гидролиза лактозы в молочных продуктах, так и для приема внутрь, является весьма актуальным и практически важным [5].

Конкуренция в сфере производства и применения препаратов β-галактозидазы оправдывает все возрастающие усилия ученых и производственников, направленные на поиск новых штаммов-продуцентов, изучение закономерностей биосинтеза ферментов и свойств ферментных белков – основы создания рентабельных биотехнологий их производства и применения [4].

Лактазу получают из различных источников: животных, растений и микроорганизмов (бактерии, грибы, дрожжи). Однако бактериальные ферменты небезопасны для применения в пищевой промышленности. Ферменты из животных и растительных источников дороги и неактивны. Наиболее пригодны для практического применения грибные и дрожжевые β-галактозидазы.

Целью работы является анализ известных микроорганизмов-продуцентов фермента, выделение лучших для дальнейших исследований.

 

Объекты и методы исследований

Теоретические и экспериментальные исследо-вания проведены в соответствии с поставленными задачами в научно-образовательном центре Госу-дарственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский тех-нологический институт пищевой промышленности». Весь цикл исследований состоял из нескольких взаимосвязанных этапов.

На первом теоретическом этапе для форму-лировки цели и задач собственных исследований проводили анализ доступной отечественной и зарубежной научной информации по теме работы.

Второй этап посвящен изучению микро-организмов, обладающих наибольшей лактазной активностью. На этом этапе контролируемыми параметрами были изменение скорости роста биомассы в процессе культивирования, определение оптимальной температуры, продолжительность культивирования. Далее определяли основные пара-метры выросших микроорганизмов: содержание сухих веществ, прирост биомассы и β-галакто-зидазную активность.

Объектами исследований на разных этапах явля­лись:

– микроскопические грибы Penicillium canescens F178;

бактерии Bacillus subtilis В2273, Bacillus coagulans В4521 и Streptococcus thermophillus B5329;

– дрожжи Kluyveromyces marxianus Y3240 и Kluyveromyces lactis Y3268.

Представленные микроорганизмы являются ак­тивными продуцентами фермента β-галактозидазы. Питательные среды для вышеперечисленных штам­мов микроорганизмов представлены в табл. 1–5.

 

Таблица 1

 

Состав среды для Penicillium canescens

 

Ингредиенты

Количество

Неохмеленное сусло 3,5 Б

1,0 л

Агар

20 г

 

Таблица 2

 

Состав среды для Bacillus subtilis

 

Ингредиенты

Количество

Дистиллированная вода

1,0 л

Пептон

10,0 г

Агар

20,0 г

NaCl

5,0 г

 

Таблица 3

 

Состав среды для Bacillus coagulans

 

Ингредиенты

Количество

Дистиллированная вода

1 л

Обезжиренный фарш

500 г

Пептон

10 г

Агар

20 г

NaCl

5 г

 

 

 

Таблица 4

 

Состав среды для Streptococcus thermophillus

 

Ингредиенты

Количество

Пептон

10,0 г

Дрожжевой экстракт

5,0 г

Мясной экстракт

5,0 г

Na2HPO4

8,5 г

KH2PO4

2,0 г

MgSO4×7 H2O

1,0 г

Лактоза

10,0 г

Агар

10,0 г

Дистиллированная вода

1,0 л

 

Таблица 5

 

Состав среды для Kluyveromyces marxianus

и Kluyveromyces lactis

 

Ингредиенты

Количество

NaNO3

3,0 г

KH2PO4

1,0 г

MgSO4×7 H2O

0,5 г

KCl

0,5 г

FeSO4×7 H2O

0,01 г

Глюкоза

30,0 г

Агар

20,0 г

Дистиллированная вода

1,0 л

 

Определение активной кислотности (рН) осуще­ствляют потенциометрическим методом, используя электронный рН-метр. Использование данного при­бора позволяет измерять pH в более широком диапазоне и более точно (до 0,01 единицы pH), чем с по­мощью лакмусовой бумаги. Данные заносят в таб­лицу.

Титруемую кислотность определяют методом титрования культуральной жидкости 0,1 М раство­ром NaOH в присутствии индикатора фенолфта­леина. Одновременно определение титруемой ки­слотности необходимо проводить в трех повторе­ниях, в таблицу вносят средний результат.

Метод определения содержания сухих веществ – рефрактометрический. Этот метод основан на зави­симости показателя преломления света от состава системы.

Для определения скорости прироста микроорга­низмов используется метод отделения мицелия от культуральной жидкости при помощи фильтрования. Разность между массой фильтра с сухим мицелием и массой пустого фильтра является массой сухого ми­целия, образовавшегося за период культивирования микроорганизма в термостате. Значения прироста биомассы заносят в таблицу. Исходя из полученных данных вычисляют общую скорость роста микроор­ганизма, измеряемую в г/ч.

Определение β-галактозидазной активности про­водили в отфильтрованной культуральной жидкости,
гомогенизированной и без разрушения клеточной стенки на фотоэлектроколориметре при длине волны 405 нм.

Разрушение клеточных стенок осуществляют на гомогенизаторе SCIENTZ-II D, воздействуя на клетки ультразвуком с частотой 22 кГц, при сле­дующем режиме: озвучивание клеток производится 4 раза, общее время 30 с, в течение которого им­пульсы продолжительностью 2 с чередуются с 2 с перерыва. Целью гомогенизации является высвобо­ждение внутриклеточного фермента во внешнюю среду.

 

Результаты и их обсуждение

Существенным фактором, оказывающим влияние на рост и метаболизм микроорганизмов, является температура культивирования. Для выбора опти­мальной температуры следили за изменением скоро­сти роста биомассы, значения которой представлены в табл. 6.

 

Таблица 6

 

Изменение биомассы

в процессе культивирования микроор­ганизмов

 

Температура, оС

Количество микроорганизмов,

тыс. КОЕ/г

1

сутки

3

сутки

5

сутки

7

сутки

Penicilliun canescens

28±2

24±2

70±2

120±3

180±5

32±2

8±1

20±2

34±2

44±3

Streptococcus thermophillus

37±2

18±2

35±2

100±3

107±3

42±2

40±2

83±3

120±4

132±4

Bacillus subtilis

37±2

400±12

сплошной рост

42±2

сплошной рост

Bacillus coagulans

37±2

сплошной рост

42±2

сплошной рост

Kluyveromyces marxianus

28±2

10±1

18±2

27±2

40±2

32±2

6±1

11±1

15±2

36±2

Kluyveromyces lactis

28±2

43±3

50±3

93±4

120±4

32±2

18±2

25±2

72±3

112±4

 

В результате анализа данных, представленных в табл. 6, можно сделать вывод о том, что оптималь­ной температурой для роста микроорганизма Penicilliun canescens является 28 ºС, для Streptococcus thermophillus – 42 ºС, для Bacillus coagulans и Bacillus subtilis – 37 ºС, для Kluyveromyces marxianus и Kluyveromyces lactis – 28 ºС. Дальнейшее культиви­рование представленных штаммов в пробирках на скошенном агаре и в жидких питательных средах  проводили при выбранных температурах. Продолжи­тельность культивирования для каждого штамма бу­дет составлять 1, 3, 5 и 7 суток.

После культивирования микроорганизмов на жидких питательных средах определяют основные контролируемые параметры. В табл. 7 представлено содержание сухих веществ в питательной среде до культивирования, а также в фильтрате для каждого исследуемого штамма.

 Таблица 7

 

Массовая доля сухих веществ в фильтрате

 

Массовая доля сухих веществ, %

До куль­тиви­рова­ния

Тем­пера-тура, оС

В процессе культивирования

1

сутки

3

сутки

5

сутки

7

сутки

Penicilliun canescens

1,1±0,1

28±2

1,1±0,1

1,2±0,1

1,2±0,1

1,5±0,1

Streptococcus thermophillus

1,7±0,1

42±2

1,8±0,1

2,1±0,1

2,2±0,1

3,1±0,1

Bacillus subtilis

2,5±0,1

37±2

2,9±0,1

3,0±0,1

3,1±0,1

3,6±0,1

Bacillus coagulans

2,5±0,1

37±2

2,5±0,1

3,1±0,1

3,6±0,1

4±0,1

Kluyveromyces marxianus

3,1±0,1

28±2

3,0±0,1

3,1±0,1

3,1±0,1

3,2±0,1

Kluyveromyces lactis

3,1±0,1

28±2

3,6±0,1

3,6±0,1

3,7±0,1

4±0,1

 

По данным табл. 7 видим, что массовая доля су­хих веществ возрастает с увеличением продолжи­тельности культивирования. Наибольшая массовая доля сухих веществ наблюдается у штамма Bacillus coagulans и составляет (1,5±0,1) %, наименьшая – у Kluyveromyces marxianus и составляет (0,2±0,1) %.

Определение прироста биомассы у изучаемых микроорганизмов представлено в табл. 8. Прирост биомассы – это количественное увеличение популя­ции клеток микроорганизма за определенный про­межуток времени. Этот способ наиболее пригоден, в частности, для организмов, образующих мицелий, нити или скопления клеток.

 

Таблица 8

 

Прирост биомассы

 

Тем­пера­тура,

оС

Биомасса, г

Общая

скорость роста, г/ч

1 сутки

3 сутки

5 сутки

7 сутки

Penicilliun canescens

28±2

0,06±0,01

0,06±0,01

0,07±0,01

0,08±0,01

0,0028±0,01

Streptococcus thermophillus

42±2

0,04±0,01

0,05±0,01

0,06±0,01

0,06±0,01

0,0022±0,01

Bacillus subtilis

37±2

0,08±0,01

0,11±0,01

0,18±0,02

0,22±0,01

0,0061±0,01

Bacillus coagulans

37±2

0,08±0,01

0,11±0,01

0,14±0,01

0,30±0,01

0,0065±0,01

Kluyveromyces marxianus

28±2

0,16±0,01

0,2±0,01

0,23±0,01

0,56±0,01

0,0119±0,01

Kluyveromyces lactis

28±2

0,03±0,01

0,06±0,01

0,16±0,01

0,33±0,01

0,00605±0,01

 

Наибольшим приростом биомассы отличаются дрожжи вида Kluyveromyces marxianus, общая ско­рость роста составляет (0,0119±0,01) г/ч, тогда как наименьшая скорость роста (0,0022±0,01) г/ч наблю­дается у бактерий вида Streptococcus thermophillus. Таким образом, можно сделать вывод, что дрожжи активнее усваивают питательные и энергетические источники среды.

Наличие определенного фермента в препарате может быть установлено по результатам той реак­ции, которую катализирует фермент, т.е. по количе­ству образовавшихся продуктов реакции или умень­шению исходного субстрата. Результаты измерения приведены в табл. 9 и 10.

Определение активности проводили в отфильтро­ванной культуральной жидкости, гомогенизирован­ной и без разрушения клеточной стенки на фото­электроколориметре при длине волны 405 нм. По получившейся оптической плотности определили лактазную активность по калибровочному графику (рис. 1).

Пересчет лактазной активности из мкмоль/мл в ед/мг белка перевели по формуле

 

                 (1)

 

 

 

 

Рис. 1. Калибровочный график по о-нитрофенолу

 

где Д – оптическая плотность, измеренная на  спек­трофотометре при 405 нм; С – концентрация о-нит­рофенола, определяемая по калибровочной кривой (см. рис. 1), мкмоль/мл; Vинк.ср. – объем инкубацион­ной среды, мл; Vе – объем ферментного раствора, мл; t – время гидролиза, мин; m – содержание белка в 1 мл ферментного препарата, взятого для гидролиза, мг.

 

 

Таблица 9

 

Изменение β-галактозидазной активности в процессе культивирования микроорганизмов

без разрушения клеточной стенки

 

Температура,

оС

Лактазная активность, ед/мг белка

Общая лактазная активность, ед/мг белка

1 сутки

3 сутки

5 сутки

7 сутки

Penicilliun canescens

28±2

0,23±0,05

0,55±0,05

1,14±0,05

1,45±0,05

0,84±0,05

Streptococcus thermophillus

42±2

0,15±0,05

0,25±0,05

0,40±0,05

0,55±0,05

0,34±0,05

Bacillus subtilis

37±2

0,31±0,05

0,49±0,05

0,74±0,05

0,98±0,05

0,63±0,05

Bacillus coagulans

37±2

0,62±0,05

0,68±0,05

1,35±0,05

2,68±0,05

1,33±0,05

Kluyveromyces marxianus

28±2

2,95±0,05

3,03±0,05

3,38±0,05

4,06±0,05

3,36±0,05

Kluyveromyces lactis

28±2

0,68±0,05

1,05±0,05

1,43±0,05

1,89±0,05

1,26±0,05

 

Таблица 10

 

 

Изменение β-галактозидазной активности в процессе культивирования микроорганизмов

с разрушением клеточной стенки

 

Температура,

оС

Лактазная активность, ед/мг белка

Общая лактазная

активность, ед/мг белка

1 сутки

3 сутки

5 сутки

7 сутки

Penicilliun canescens

28±2

0,26±0,05

1,0±0,05

1,25±0,05

1,69±0,05

1,05±0,05

Streptococcus thermophillus

42±2

0,19±0,05

0,33±0,05

0,49±0,05

0,77±0,05

0,45±0,05

Bacillus subtilis

37±2

1,60±0,05

1,66±0,05

1,97±0,05

2,28±0,05

1,88±0,05

Bacillus coagulans

37±2

0,86±0,05

2,18±0,05

4,31±0,05

5,14±0,05

3,12±0,05

Kluyveromyces marxianus

28±2

3,38±0,05

4,25±0,05

4,65±0,05

5,48±0,05

4,44±0,05

Kluyveromyces lactis

28±2

0,74±0,05

1,11±0,05

2,09±0,05

2,35±0,05

1,57±0,05

 

 

 

Анализируя данные табл. 9 и 10, делаем вывод, что наибольшей лактазной активностью обладает штамм Kluyveromyces marxianus (общая лактазная активность составляет (3,36±0,05) и (4,44±0,05) ед/мг белка у него­могенизированной и гомогенизированной культуральной жидкости соответственно). Также высокой активно­стью отличается штамм Bacillus coagulans (общая лактазная активность составляет (1,33±0,05) и (5,14±0,05) ед/мг белка у негомогенизированной и гомогенизированной культуральной жидкости соответственно).

Наименьшая β-галактозидазная активность отмечается у штамма Streptococcus thermophillus, которая со­ставляет (0,34±0,05) и (0,45±0,05) ед/мг белка для культуральной жидкости без разрушения биомассы и разру­шенной. Заметное увеличение β-галакто-зидазной активности в процессе культивирования наблюдается на 5–7 сутки.

 

 

Выводы

 

Были исследованы штаммы микроорганизмов, обладающие β-галактозидазной активностью, и выбран наиболее продуктивный штамм – дрожжи Kluyveromyces marxianus.

Изучены основные показатели полученного фермента лактазы: общая β-галактозидазная активность неочи­щенного фермента составила (3,36±0,05) и (4,44±0,05) ед/мг белка у негомогенизированной и гомогенизированной

Список литературы

1. Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Агропромиздат, 1987. - 335 с.

2. Докучаева, Г.А. Рынок ферментов: в ожидании перемен [Электронный ресурс]. - URL: http://www.abercade.ru/research/analysis/1988.html

3. Общая технология микробиологических производств / М.С. Мосичев, А.А. Складнев, В.Б. Котов. - М.: Легкая и пи¬щевая пром-сть, 1982. - 264 с.

4. Особенности продукции внеклеточных β-галактозидаз мицелиальными грибами / Л.И. Сапунова, И.О. Тамкович, А.А. Костеневич [Электронный ресурс]. - URL: immunopathology.com

5. Сухих, О.А. Получение препарата грибной β-галактозидазы для коррекции лактазной недостаточности: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 2007. - 21 с.


Войти или Создать
* Забыли пароль?