Владивосток, Приморский край, Россия
Владивосток, Приморский край, Россия
С целью оценки противовоспалительного действия миллиметровой терапии при лечении больных бронхиальной астмой (БА) с частично контролируемым течением заболевания исследовали состав жирных кислот мембран эритроцитов и их оксигеназных производных. Обследовано 85 человек в возрасте от 18 до 45 лет, из них 60 пациентов с диагнозом БА частично контролируемого течения и 25 человек – группа контроля, которую составили условно здоровые лица, не имеющие бронхолегочной патологии. Сформировано две группы наблюдения. Пациенты 1-й группы (n=30) получали только базисную медикаментозную терапию (БМТ): ингаляционный глюкокортикостероид и β2-агонисты короткого действия по требованию. Пациентам 2-й группы (n=30) проводилось комплексное лечение: БМТ в сочетании с миллиметровой терапией по разработанной методике. Оценивали клинические симптомы (частота ночных и дневных приступов удушья в неделю, выраженность кашля, потребность в бронхолитиках короткого действия в течение суток), результаты опросника по контролю симптомов астмы (ACQ-5 тест), показатели функции внешнего дыхания, состав жирных кислот (ЖК) мембран эритроцитов, уровень эйкозаноидов. Динамику клинико-функциональных и лабораторных показателей у пациентов оценивали через месяц после начала лечения. В ходе исследования у больных БА установлена модификация состава ЖК мембран эритроцитов, характеризующаяся увеличением доли некоторых представителей насыщенных и мононенасыщенных ЖК, повышенной продукцией арахидоновой кислоты и её циклооксигеназных и липоксигеназных метаболитов (тромбоксан В2, лейкотриен В4) на фоне дефицита эйкозапентаеновой и докозапентаеновой кислот. В плазме крови пациентов 2-й группы, получавших комплексное лечение, выявлено значительное снижение уровня оксигеназных производных ЖК на фоне положительной динамики клинического течения заболевания, что свидетельствует о нормализации метаболических превращений оксигеназных производных ЖК и, как следствие, о стихании аллергического воспаления под воздействием электромагнитных волн миллиметрового диапазона крайне высокой частоты.
бронхиальная астма, жирные кислоты, эйкозаноиды, миллиметровая терапия.
Бронхиальная астма (БА) – одно из наиболее распространённых воспалительных заболеваний дыхательных путей [11]. Хроническое воспаление дыхательных путей регулируется сложной сетью медиаторов, ключевая роль среди которых отводится метаболитам полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) – эйкозаноидам (лейкотриены, тромбоксаны и др.), модулирующим иммунный ответ через хемотаксические, аутокринные, либо паракринные эффекты [10]. Изучение состава и соотношения жирных кислот (ЖК) цитомембран позволяет выявлять нарушения в цикле эйкозаноидов, поскольку источником эйкозаноидов являются ПНЖК мембранных фосфолипидов [12]. Одним из основных предшественников эйкозаноидов является арахидоновая кислота (20:4n-6), метаболиты которой обладают высокой провоспалительной и бронхоконстрикторной активностью, в отличие от эйкозаноидов, образующихся из эйкозапентаеновой кислоты (20:5n-3) и проявляющих противовоспалительные эффекты. При этом между арахидоновой и эйкозапентаеновой кислотами существует конкуренция за ферментные системы, а образующиеся из них эйкозаноиды являются функциональными антагонистами. Известно, что гиперсекреция цистеиновых лейкотриенов и простагландина D2 в острый период БА опосредует обструкцию за счёт воспалительного бронхоспазма с отёком слизистой и плазменной экссудацией в просвет бронха [5].
Считается, что фармакологический контроль воспаления при БА способствует нормализации многих функций и процессов, в том числе метаболизма ЖК. Однако проблема состояния липидного обмена при БА частично контролируемого течения изучена недостаточно. Вместе с тем, уточнение роли ЖК и их метаболитов в формировании системного воспаления позволит своевременно выявлять риски развития и осложнения бронхиальной обструкции. ПНЖК и их биологически активные оксипроизводные занимают важное место в клеточно-молекулярных механизмах развития и регуляции воспалительной реакции при заболеваниях бронхолегочной системы. Изучение роли ЖК и их метаболитов в формировании воспалительного процесса может стать отправной точкой для установления молекулярных и клеточных механизмов патогенеза БА, разработки новых способов лечения заболевания. В реабилитации больных БА перспективной является терапия электромагнитными волнами миллиметрового диапазона крайне высокой частоты (КВЧ-терапия), механизмы противовоспалительного действия которой остаются открытыми [7].
Цель исследования – изучение состава ЖК мембран эритроцитов, их оксигеназных производных и оценка противовоспалительного действия миллиметровой терапии при лечении БА частично контролируемого течения.
Материалы и методы исследования
Материалом исследования послужили данные обследования 85 человек в возрасте от 18 до 45 лет, из них 60 пациентов с диагнозом БА частично контролируемого течения и 25 человек – группа контроля, которую составили условно здоровые лица, не имеющие бронхолегочной патологии. Диагноз выставлен в соответствии с Глобальной стратегией лечения и профилактики БА (пересмотр 2016 г.) [11]. Исследование проведено с учетом требований Хельсинкской декларации «Рекомендации для врачей по биомедицинским исследованиям на людях» (2013). Сформировано две группы наблюдения. Пациенты 1-й группы (n=30) получали только базисную медикаментозную терапию (БМТ): ингаляционный глюкокортикостероид – мометазона фуроат в дозе 400 мкг в сутки и β2-агонисты короткого действия по требованию. Пациентам 2-й группы (n=30) проводилось комплексное лечение: БМТ в сочетании с КВЧ-терапией по разработанной методике [2].
Оценивали клинические симптомы (частота ночных и дневных приступов удушья в неделю, выраженность кашля, потребность в бронхолитиках короткого действия в течение суток), результаты опросника по контролю симптомов астмы (ACQ-5 тест), показатели функции внешнего дыхания, состав ЖК мембран эритроцитов, уровень эйкозаноидов. Динамику клинико-функциональных и лабораторных показателей у пациентов оценивали через месяц после начала лечения.
Функцию внешнего дыхания исследовали с помощью спирометрии на аппарате Master Screen Body (CareFusion, Германия): оценивали форсированную жизненную емкость легких (ФЖЕЛ), объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1) и соотношение этих параметров (ОФВ1/ФЖЕЛ).
Мембраны эритроцитов для изучения состава ЖК получали путём гемолиза клеток в дистиллированной воде и центрифугирования на центрифуге Z383K с охлаждением (HERMLE LaborTechnic, Германия) в течение 15 мин при 14000 об/мин в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) с трёхкратным промыванием. Липиды из мембран эритроцитов экстрагировали смесью хлороформ-метанол, 1:2 (по объёму) [8]. Экстракт упаривали досуха в вакууме на роторном испарителе (IKA, Германия), липиды растворяли в 0,2 мл хлороформа. Полученные фракции проверяли одномерной тонкослойной хроматографией, применяя смесь растворителей: гексан: диэтиловый эфир: уксусная кислота, 80:20:1 (по объёму). Метиловые эфиры ЖК получали трансметилированием липидного образца, прибавляя 1% раствор метилатнатрия в метаноле и нагревая 15 мин при 50ºC, затем добавляя 5% HCl в метаноле и нагревая 15 мин при 50ºC [9]. Метиловые эфиры экстрагировали гексаном. Очистку метиловых эфиров проводили микротонкослойной хроматографией в бензоле. Эфиры элюировали хлороформом, раствор упаривали на роторном испарителе. Перерастворенные в гексане метиловые эфиры ЖК анализировали на газожидкостном хроматографе Shimadzu GC-2010 (Япония), снабжённом пламенно-ионизационным детектором, капиллярной колонкой (0,25 мм×30 м) с привитой фазой Supelcowax 10. Температура колонки – 210ºC, температура детектора – 250ºС. Газ-носитель – гелий. ЖК идентифицировали по относительным временам удерживания и по расчётным значениям эквивалентной длине цепи, так называемым значениям «углеродных чисел». Результаты выражали в процентах от суммы ЖК.
Уровень эйкозаноидов в плазме крови оценивали по количеству их стабильных метаболитов – тромбоксана В2 (ТХВ2) и лейкотриена В4 (ЛТВ4). Для выделения эйкозаноидов использовали миниколонки Minicolumns for Sample Preparation (США), количественный уровень определяли иммуноферментным методом (тест-системы Biotrak EIA system ʹʹAmersham Biosciences UKʹʹ, Великобритания). Измерение проводили в плоскодонных 96-луночных планшетах на спектрофотометре «Biotek Power Wave» (США).
Статистическая обработка материалов производилась с помощью программного обеспечения STATISTICA 10 (StatSoft Inc., США) и Excel (Microsoft Office 2016). Проверку гипотезы нормальности распределения количественных признаков в группах оценивали с помощью критериев Колмогорова-Смирнова, Шапиро-Уилка и критерия согласия Пирсона χ². Сравнение средних значений количественных признаков в зависимых и независимых группах с распределением, соответствующим нормальному закону, и при соблюдении условия равенства (гомоскедастичности) дисперсий, проводили с помощью параметрического t-критерия Стьюдента. В противном случае статистическую значимость различий оценивали с помощью непараметрических критериев: для зависимых выборок применяли критерии Вилкоксона и Знаков, для независимых – критерии Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Дескриптивные статистики в тексте представлены как М±m (где М-среднее, m-стандартная ошибка средней величины). Сравнительный анализ данных оформлен в виде таблиц и диаграмм размаха [1, 3, 4, 6].
Результаты исследования и их обсуждение
При анализе клинической картины у пациентов 1-й и 2-й групп констатировалось ограничение активности, симптомы дыхательного дискомфорта, снижение толерантности к физической нагрузке, потребность в β2-агонистах короткого действия более двух раз в неделю в дневное время и чаще двух раз в месяц в ночное время. Результаты ACQ-5 теста соответствовали уровню частичного контроля заболевания и варьировали в диапазоне 0,75-1,5 балла.
При изучении состава ЖК липидов мембран эритроцитов у больных БА частично контролируемого течения отмечены изменения в количественной и качественной характеристике ЖК. Анализ количественного состава ЖК выявил увеличение доли насыщенных (лауриновой и стеариновой) и мононенасыщенных (пальмитоолеиновой) ЖК по сравнению с группой здоровых лиц. В пуле ПНЖК отмечено снижение эссенциальной линолевой кислоты, α-линоленовой кислоты, γ-линоленовой кислоты семейства n6, эйкозапентаеновой и докозапентаеновой кислоты семейства n6, а так же увеличение содержания докозатетраеновой и арахидоновой кислоты – главного субстрата синтеза провоспалительных и бронхоконстрикторных эйкозаноидов (табл. 1).
Установлено, что доля основного антагониста арахидоновой кислоты – эйкозапентаеновой кислоты, снижена в 1,6 раза относительно контрольной группы.
Полученные данные свидетельствуют, что при БА хроническое воспаление ассоциируется со значительными изменениями состава ЖК клеточных мембран: накоплением насыщенных ЖК, арахидоновой кислоты – главного субстрата синтеза провоспалительных и бронхоконстрикторных эйкозаноидов, истощением пула эйкозапентаеновой кислоты. Повышенное содержание арахидоновой кислоты в мембране эритроцитов, приводящее к усилению выработки медиаторов воспаления (лейкотриен В4) и бронхоконстрикторов (тромбоксан В2) и дисбалансу между продукцией про- и противовоспалительных эйкозаноидов, указывает на нарушения метаболизма ПНЖК.
В пользу патогенетической значимости выявленных нарушений состава ЖК свидетельствуют результаты изучения эйкозаноидов у больных БА. При анализе исходного уровня тромбоксана В2 и лейкотриена В4 выявлено значительное увеличение их содержания в плазме крови у больных БА по сравнению с группой контроля (табл. 2). Исходное содержание ЛТВ4 как в 1-й, так и во 2-й группах превышало нормальные значения практически в 5 раз, уровень ТХВ2 в обеих группах был увеличен в 2 раза.
Таблица 1
Состав ЖК мембран эритроцитов у пациентов с частично контролируемой БА
|
Жирные кислоты, % от суммы ЖК |
Контрольная группа (n=25) |
Больные БА (n=60) |
|
Насыщенные жирные кислоты |
||
|
12:0-лауриновая кислота |
0,13±0,01 |
***0,27±0,04 |
|
14:0-тетрадекановая кислота |
0,39±0,03 |
0,44±0,04 |
|
15:0-пентадекановая кислота |
0,17±0,01 |
0,18±0,01 |
|
16:0-пальмитиновая кислота |
23,98±1,28 |
22,22±0,51 |
|
17:0-гептадекановая кислота |
0,35±0,02 |
0,32±0,01 |
|
18:0-стеариновая кислота |
13,40±0,75 |
**17,52±0,98 (p=0,002) |
|
20:0-экозановая кислота |
0,150±0,035 |
0,110±0,007 |
|
Мононенасыщенные жирные кислоты |
||
|
16:1n-9-пальмитоолеиновая кислота семейства n9 |
0,21±0,05 |
***0,33±0,02 |
|
16:1n-7-пальмитоолеиновая кислота семейства n7 |
0,39±0,03 |
0,37±0,02 |
|
18:1n-9-олеиновая кислота |
14,84±0,84 |
13,89±0,27 |
|
18:1n-7-октадеканомоноеновая кислота семейства n7 |
1,53±0,08 |
1,53±0,05 |
|
18:1n-5-октадеканомоноеновая кислота семейства n5 |
0,32±0,02 |
0,40±0,04 |
|
20:1-экозамоноеновая кислота |
0,34±0,07 |
0,26±0,01 |
|
Полиненасыщенные жирные кислоты |
||
|
18:2n-6-линолевая кислота |
15,75±0,48 |
*13,88±0,53 (p=0,011) |
|
18:3n-3-α-линоленовая кислота |
0,20±0,02 |
*0,15±0,01 (p=0,028) |
|
20:3n-6-дигомо-γ-линоленовая кислота семейства n6 |
1,29±0,02 |
*1,21±0,03 (p=0,029) |
|
20:4n-6-арахидоновая кислота |
12,95±0,25 |
**14,16±0,29 (p=0,002) |
|
20:5n-3-эйкозапентаеновая кислота |
1,23±0,04 |
***0,77±0,03 |
|
22:4n-6-докозатетраеновая кислота |
2,37±0,09 |
*2,83±0,15 (p=0,010) |
|
22:5n-6-докозапентаеновая кислота семейства n6 |
0,37±0,01 |
***0,23±0,01 |
|
22:5n-3-докозапентаеновая кислота семейства n3 |
1,99±0,02 |
2,04±0,09 |
|
22:6n-3-докозагексаеновая кислота |
4,67±0,85 |
5,45±0,31 |
Примечание: (*) – статистическая значимость различий относительно контрольной группы: * – p<0,05; ** – p<0,01; *** – p<0,001.
Таблица 2
Динамика уровня эйкозаноидов у больных частично контролируемой БА на фоне проводимого лечения
|
Показатели |
Группа контроля (n=25) |
1-я группа (n=30) |
2-я группа (n=30) |
||
|
До лечения |
После лечения |
До лечения |
После лечения |
||
|
ЛТВ4, пг/мл |
10,35±1,41 |
51,53±2,04* |
42,34±2,17 |
48,93±1,99* |
31,22±2,17** |
|
ТХВ2, пг/мл |
15,87±1,07 |
34,77±2,17* |
30,85±2,09 |
32,96±2,23* |
25,68±2,17** |
Примечание: * – статистическая значимость различий относительно контрольной группы (p<0,001); ** – статистическая значимость различий до и после лечения (p<0,01).
Таким образом, как показали исследования, течение хронического воспаления в период ремиссии у больных БА частично контролируемого течения опосредуется интенсивной продукцией провоспалительных и бронхоконстрикторных эйкозаноидов.
После проведенного лечения сравнительный анализ состояния пациентов показал более выраженную положительную динамику клинических проявлений у пациентов 2-й группы, получавших БМТ в сочетании с миллиметровой терапией. У пациентов 1-й и 2-й групп констатировалось улучшение общего состояния, отсутствие симптомов дыхательного дискомфорта, повысилась толерантность к физической нагрузке, исчезла потребность в β2-агонистах короткого действия более двух раз в неделю в дневное время (в 1-й группе у 76%, во 2-й группе у 74% пациентов) и чаще двух раз в месяц в ночное время (в 1-й группе у 50%, во 2-й группе у 26% пациентов). Показатель результатов ACQ-5 теста в 1-й группе снизился на 22%, оставаясь на уровне частичного контроля (0,75-1,5 балла). Во 2-й группе результат ACQ-5 теста снизился на 42%, и отмечено достижение уровня полного контроля БА (<0,75 баллов) в 80% случаев (рис. 1).
Рис. 1. Динамика показателей ACQ-5 теста по контролю симптомов астмы на фоне проводимого лечения, баллы.
Рис. 2. Динамика показателей бронхиальной проходимости у больных частично контролируемой БА на фоне проводимого лечения, % от должного.
Оценка показателей функции внешнего дыхания выявила у пациентов обеих групп улучшение бронхиальной проходимости. Статистически значимое увеличение ОФВ1 у пациентов 2-й группы свидетельствует о более существенной положительной динамике на фоне комплексного лечения (рис. 2).
При изучении динамики уровня эйкозаноидов в плазме крови пациентов с БА отмечено снижение содержания тромбоксана В2 и лейкотриена В4 на фоне проводимого лечения (табл. 2). Уровень ТХВ2 в 1-й группе снизился на 11,3%, а во 2-й – на 22,1%. Уровень ЛТВ4 в 1-й группе снизился на 17,8%, а во 2-й – на 36,2%. Статистически значимое изменение показателей в группе пациентов, получавших комплексное лечение, свидетельствует о более выраженном противовоспалительном эффекте на фоне применения миллиметровой терапии в лечении БА частично контролируемого течения.
Выводы
При частично контролируемой БА установлена модификация состава ЖК мембран эритроцитов, характеризующаяся увеличением доли некоторых представителей насыщенных и мононенасыщенных ЖК, повышенной продукцией арахидоновой кислоты и её циклооксигеназных и липоксигеназных метаболитов (тромбоксан В2, лейкотриен В4) на фоне дефицита эйкозапентаеновой и докозапентаеновой кислот. Изменения состава ЖК мембран эритроцитов крови и нарушение синтеза их оксигеназных производных свидетельствуют о важном значении ЖК и их метаболитов в иммунометаболических механизмах формирования системной воспалительной реакции при БА частично контролируемого течения. Смещение динамического равновесия в сторону накопления предшественника провоспалительных эйкозаноидов ассоциируется с развитием и прогрессированием нарушений при БА и становится одной из главных причин формирования воспаления. Выявленные нарушения подтверждают, что поддержание хронического воспаления при БА осуществляется биологически активными метаболитами полиненасыщенных ЖК – провоспалительными эйкозаноидами.
Значительное снижение уровня оксигеназных производных ЖК в плазме крови при частично контролируемой БА и положительная динамика клинического течения заболевания на фоне миллиметровой терапии свидетельствует о нормализации метаболических превращений оксигеназных производных ЖК, и как следствие – о стихании аллергического воспаления под воздействием электромагнитных волн миллиметрового диапазона крайне высокой частоты.
1. Банержи А. Медицинская статистика понятным языком: вводный курс (пер. с англ.). М: Практическая медицина, 2007. 287 с.
2. Гвозденко Т.А., Антонюк М.В., Фотина О.Н., Степанова О.П. Применение КВЧ терапии в комплексной реабилитации больных бронхиальной астмой: медицинская технология. Владивосток, 2015. 15 с.
3. Гржибовский А.М. Типы данных, проверка распределения и описательная статистика // Экология человека. 2008. №1. С.52-58.
4. Гржибовский А.М. Анализ количественных данных для двух независимых групп // Экология человека. 2008. №2. С.54-61.
5. Денисенко Ю.К., Новгородцева Т.П., Лобанова Е.Г., Калинина Е.П. Состав жирных кислот клеток крови в условии системного воспаления при хронических заболеваниях органов дыхания // Национальная Ассоциация ученых. 2015. №5-4(10). С.26-29.
6. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: Медиа Сфера, 2002. 312 с.
7. Ходосова К.К., Гвозденко Т.А., Антонюк М.В., Минеева Е.Е., Юренко А.В., Переломова О.В. Влияние КВЧ-терапии на состояние цитокинового статуса у больных частично контролируемой бронхиальной астмой // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2017. №4(71). С.63-68. http://doi.org/10.5281/zenodo.835326
8. Bligh E.C., Dyer W.J.A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. Vol.37, №8. Р.911-917. doi:https://doi.org/10.1139/o59-099
9. Carreau J.P., Dubacq J.P. Adaptation of a macro-scale method to the micro-scale for fatty acid methyl transesterification of biological lipid extract // J. Chromatogr. 1978. Vol.151, Iss.3. Р.384-390. https://doi.org/10.1016/S0021-9673(00)88356-9
10. Giudetti A.M., Cagnazzo R. Beneficial effects of n-3 PUFA on chronic airway inflammatory diseases // Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2012. Vol.99, №3-4. Р.57-67. doi:https://doi.org/10.1016/j.prostaglandins.2012.09.006
11. Global Initiative for Asthma (GINA). Global strategy for asthma management and prevention (Update 2016). URL: http://ginasthma.com.
12. Novgorodtseva T.P., Denisenko Yu.K., Zhukova N.V., Antonyuk M.V., Knyshova V.V., Gvozdenko T.A. Modification of the fatty acid composition of the erythrocyte membrane in patients with chronic respiratory diseases // Lipids in Health and Disease. 2013. Vol.12. P.117.
