Работа представляет оригинальное исследование, посвященное клеточной и тканевой реконструкции повреждения спинного мозга у взрослых крыс с экспериментальной позвоночно-спинальной травмой. После выполнения лами-нэктомии, частичного и полного механического пересечения спинного мозга на уровне IX грудного позвонка в дефект спинного мозга имплантировано изделие медицинского назначения, содержащее бычий коллаген и крабовый хитозан, сульфатирован-ные и несульфатированные гликозаминогликаны, полную питательную среду, кондиционированную питательную среду с ней-ротрофическими факторами роста от клеток головного мозга эмбрионов мышей и эмбриональных стволовых клеток мыши, N2 нейрональную добавку, ретиноевую кислоту. Динамический неврологический статус животных показал существенное сокращение дефицита по шкале оценки выраженности неврологического дефицита при полной транссекции в течение 20 недель постимплантационного периода. Метод иммунофлуоресценции клеток диспергатов спинного мозга и гистологических срезов подтверждает присутствие активного внедрения клеток спинного мозга крысы в имплантат, высокую жизнеспособность трансплантированных предшественников нейрональных клеток мыши в течение всего периода наблюдения, формирование через 1 неделю после трансплантации клеток нейрональной ткани с экспрессией медиаторов передачи нервного сигнала. Эти изменения в контроле сопровождаются частичным восстановлением двигательной, сенсорной и вегетативной функции спинного мозга, сокращением уровня нейродефицита, равного 5.6 баллов по шкале оценки выраженности неврологического дефицита при полной транссекции. Трансплантация коллаген-хитозановой матрицы, содержащей 100 тыс. клеток - нейрональных предшественников приводит в течение 20 недель наблюдения к сохранению их жизнеспособности, формированию многочисленных нейронов, образующих межсинаптические связи, ранней экспрессии нейротрансмиттеров, существенным восстановлением нарушенных двигательных и чувствительных функций спинного мозга, достигая уровня сокращения нейродефицита, равного 19.5 баллов по шкале оценки выраженности неврологического дефицита при полной транссекции.
коллаген-хитозановая подложка, предшественники нейронов, травма спинного мозга, нейротрансмиттеры
Стандарт первичной хирургической обработки осложненной позвоночно-спинальной травмы не предусматривает реконструкцию спинного мозга, включает выполнение операции укрепления позвонков и стабилизацию позвоночника относительно спинного мозга. В экспериментальной практике при постановке задачи реконструкции спинного мозга при его повреждении используют аутологичные, аллогенные или ксеногенные стволовые клетки, выделенные и культивированные из костного мозга, жировой ткани, периферической крови и других мест дислокации. При этом имплантация клеток осуществляется либо в свободном виде в качестве инъекции в место дислокации травмы спинного мозга или субарахноидально, либо клетки помещаются в гидрогелевую основу и в таком виде вводятся в место травмы после оперативного доступа через костные элементы позвоночника и обнажения спинного мозга. Результаты таких манипуляций малоудовлетворительны, характеризуются далеко неполной положительной неврологической динамикой, слабым морфологическим контролем реконструкции. Проблема спинальной травмы состоит в отсутствии эффективных сертифицированных методов реконструкции миеломаляционных очагов при спинальной травме с восстановлением анатомической и функциональной целостности проводящих путей. Предлагаемые методы реконструкции предусматривают использование нейронов в питательных средах, в том числе полученных из эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСКч). Использование дифференцированных дериватов недостаточно эффективно по причине их низкой массы, непродолжительной жизнеспособности, большой потери при трансляции с подложек в дислокацию травмы. Известны различные протоколы получения дифференцированных дериватов нейрональных клеток из стволовых клеток. В этих протоколах для переноса клеток с культуральных флаконов используют растворы энзимов (трипсина, коллагеназы, дес-пазы и т.п.). Эти манипуляции приводят к увеличению уровня апоптоза, клеточной гибели, повреждению поверхностных клеточных рецепторов [5]. Создание и испытание биоде-градируемых матриц, создающих благоприятные условия для культивирования и дифференцировки ЭСК, является весьма востребованной задачей. Возможность регенерации проводящих путей спинного мозга (СМ) существенно ограничена в связи с необратимыми морфологическими изменениями в нервной ткани после повреждения, особенно в кау-дальной ее части. За последнее время накоплены важные экспериментальные данные и ограниченный клинический материал, свидетельствующий о принципиальной возможности регенерации в центральной нервной системе (ЦНС) и возможном восстановлении ее нарушенных функций в течение достаточно длительного времени, несмотря на применение модели с полным пересечением спинного мозга у экспериментальных животных [15,20,29]. Полученные научные факты позволяют предложить новые стратегии и концепции лечения повреждений СМ. Основным инструментом регенеративной медицины являются различные клеточные технологии от трансплантации клеток (клеточная терапия) до тканевой инженерии. В этом смысле речь идет о введении нейрональных клеток или их предшественников при травматическом повреждении СМ в его микроокружение на основе трехмерных биодеградируемых подложек. Перспективным направлением в регенераторной клеточной терапии можно считать трансплантацию предшественников нейрональных клеток или нейрональных стволовых клеток (НСК), которые получают из нейроэпителия эмбриона. Направленное культивирование СК приводит к их нейрональной дифференци-
1. Применение полисахаридной нейрональной матрицы при лечении экспериментальной спинальной травмы / И.Н. Большаков [и др.]// Вопросы реконструктивной и пластической хирургии- 2012- Т. 15.- №1.- С. 34^12.
2. Коллаген-хитозановая матрица для культивирования и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в клетки нейрональной природы. Маркерный анализ / И.Н. Большаков [и др.]// Фундаментальные исследования- 2012 - №1.- С. 18-23.
3. Трансплантация клеточной полисахаридной подложки при частичном спинальном разрыве у крыс. Динамический неврологический контроль / И.Н. Большаков [и др.] // Фундаментальные исследования- 2012- №2 - С. 31-34.
4. Функции культивируемых эмбриональных клеток на коллаген-хитозановой матрице / А.В. Еремеев [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия - 2009.- № 4.- С. 55-62.
5. Жизнеспособность и функции плюрипотентных клеток и фибробластов дермально-эпидермального слоя животных в условиях их культивирования на коллаген-хитозановых покрытиях / А.В. Еремеев [и др.] // Сиб. мед.обозрение.- 2008.- №6.- С. 24-27.
6. Andrews, M.R. Evaluation of olfactory ensheathing and Schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord / D.J. Andrews, D.J. Stelzenr // J. Neurotrauma - 2007.- V.24- P. 1773-1792.
7. Basso, D.M. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats / D.M. Basso, M.S. Beattie, J.C. Bresnahan // J. Neurotrauma.- 1995.- V.12.- P. 1-21.
8. Baumann, M.D. Intrathecal delivery of a polymeric na-nocomposite hydrogel after spinal cord injury / M.D. Baumann, C.E. Kang, C.H. Tator, M.S. Shoichet // Biomaterials.- 2010.-V.31.-P. 7631-7639.
9. Cheng, H. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury / H. Cheng, Y.C. Huang, P.T. Chang, Y.Y. Huang// Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2007.- V. 357.- P.938-944.
10. Survival and migration of human and rat olfactory ensheathing cells in intact and injured spinal cord / C. Deng [et al.] // J. Neurosci. Res.- 2006.- V.83.- P.1201-1212.
11. Eremeev, A.V. Patent RU. 2010. Method for producing a neural matrix / A.V. Eremeev, A.V. Svetlakov, I.N. Bol´shakov, Ju.I. Sheina, A.M. Polstyanoy. PCT/ RU2011/000213 № WO/2011/142691.
12. Fitch, M.T. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure / M.T. Fitch, J. Silver // Exp Neurol.- 2008.- V.209.- P.294-301.
13. Franssen, E.H.P. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord / E.H.P. Franssen, F.M. de Bree, J. Verhaagen // Brain Res. Rev.- 2007.- V.56.- P.236-258.
14. Gros, T. Regeneration of long-tract axons through sites of spinal cord injury using templated agarose scaffolds / T. Gros, J.S. Sakamoto, A. Blesch, L.A. Havton, M.H. Tuszynski // Biomaterials.- 2010.- V.31.- P. 6719-6729.
15. Poly(D,L-lactic acid) macroporous guidance scaffolds seeded with Schwann cells genetically modified to secrete a bi-functional neurotrophin implanted in the completely transected adult rat thoracic spinal cord / A. A. Hurtado [et al.] // Biomaterials.- 2006.- V.27.- P.430^42.
16. Li, X. The effect of neurotrophin-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells / X. Li, Z. Yang, A. Zhang // Biomaterials.- 2009.- V.30.- P.4978-4985.
17. Li, X.G. Studies on repairing of hemisected thoracic spinal cord of adult rats by using a chitosan tube filled with alginate fibers / X.G. Li, Z.Y. Yang, Y. Yang // Prog. Nat. Sci.-2006.- V.16.- P.1051-1055.
18. Li, X.G. Repair of thoracic spinal cord injury by chitosan tube implantation in adult rats / X.G. Li, Z.Y. Yang, A.F.Zhang, T.L. Wang, W.C. Chen// Biomaterials.- 2009.-V.30.-P.1121-1132.
19. Olfactory ensheathing cells do not exhibit unique migratory or axonal growth-promoting properties after spinal cord injury / P. Lu [et al.] // J. Neurosci.- 2006.- V.26.- P.11120-11130.
20. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration / M.J. Moore [et al.] // Biomaterials- 2006 - V.27.- P.419^29.
21. Conditional ablation of Stat3 or Socs3 discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury / S. Okada [et al.] // Nat. Med.- 2006.- V.12.- P.829-834.
22. In vitro behavior of neural stem cells in response to different chemical functional groups / Y.-J. Ren [et al.]// Biomaterials.- 2009.- V.30.- P.1036-1044.
23. Thuret, S. Therapeutic interventions after spinal cord injury / S. Thuret, L.D.F. Moon, F.H. Gage // Nat. Rev. Neurosci.- 2006.- V.7.- P.628-643.
24. Induced pluripotent stem cells for neural tissue engineering / A. Wang [et al.]// Biomaterials.- 2011.- V.32.- P. 5023-5032.
25. Wang, D.D. The astrocyte odyssey / D.D. Wang, A. Bordey // Progress in Neurobiol.- 2008.- V.86.- P.342-367.
26. Cograft of neural stem cells and schwann cells over-expressing TrkC and neurotrophin-3 respectively after rat spinal cord transaction / J.-M. Wang [et al.] // Biomaterials- 2011 - V.32.- P.7454-7468.
27. Clinical observation of fetal olfactory ensheathing glia transplantation (OEGT) in patients with complete chronic spinal cord injury / J. Wu [et al.] // Cell Transplantation- 2012.- V.21.-P.33-37.
28. Synaptic transmission of neural stem cells seeded in 3-dimensional PLGA scaffolds / Yi. Xiong [et al.]// Biomaterials.- 2009.- V.30.- P.3711-3722.
29. Yang, Z. The effect of the dosage of NT-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells / Z. Yang, H. Duan, H. Mo, H. Qiao, X. Li // Biomaterials.-2010.- V.31.- P. 4846-854.
30. Yiu, G. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nature reviews / G. Yiu, Z.G. He // Neuroscience- 2006- V.7.- P. 617-627.
