Цель исследования – разработка метода ДНК-диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота. Материалы и методы. Пробы крови отбирали из хвостовой вены с использованием ЭДТА в качестве антикоагулянта. ДНК выделяли с помощью набора Sorb-M. Для анализа гена msp4 были использованы соответствующие последовательности, принадлежащие разным изолятам Anaplasma marginale. Выявление консервативных участков последовательностей для подбора праймеров проводили с помощью сервера СlustalW2. Видоспецифичность праймеров проверяли с использованием алгоритма BLASTN. Результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) оценивали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Электрофорез проводили в течение 40 минут при напряженности поля 5 В/см. Полученные в результате ПЦР фрагменты гена msp4 были очищены, лигированы и клонированы в клетках E. coli. Трансформацию проводили методом теплового шока. Поиск колоний E. coli DH5α, содержащих плазмиду pGEM-msp4, проводили методом ПЦР с использованием стандартных праймеров M13 с последующим анализом результатов ПЦР методом электрофореза. Целевые колонии наращивали в течение ночи при 37 °С в 2 мл среды LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Секвенирование полученных плазмид pGEM-msp4 осуществляли по методу Сэнгера и генетического анализатора Applied Biosystems 3130. Результаты и обсуждение. Описаны разработка и апробация праймеров к гену msp4 Anaplasma marginale для ДНК-диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота методом ПЦР. Чувствительность ПЦР с использованием этих праймеров позволяет выявить 100 и больше копий гена. Проведенные испытания свидетельствуют о 100%-ной повторяемости и воспроизводимости данного метода.
: Anaplasma marginale, крупный рогатый скот, диагностика, ПЦР.
Анаплазмоз крупного рогатого скота (КРС) – трансмиссивное инфекционное заболевание, вызываемое риккетсиями рода Anaplasma (отряд Riсkettsiales, семейство Anaplasmatacеa). Анаплазмоз КРС широко распространен во всем мире и приводит к значительным экономическим потерям вследствие уменьшения мясо-молочной продуктивности скота, ущерба от недополучения молодняка и гибели животных. Основным возбудителем анаплазмоза у КРС являются риккетсии Anaplasma. А. marginale – облигатный внутриклеточный паразит, поражающий эритроциты. Источником возбудителя являются инфицированные и больные животные, переносчиками – около 20 видов клещей, а также кровососущие насекомые. Возможна механическая передача возбудителей от зараженных животных к здоровым через нестерильные инструменты при проведении обезроживания, кастрации, вакцинации, при взятии крови и других зоотехнических мероприятий [1, 5, 10].
Анаплазмоз КРС, вызванный A. marginale, зарегистрирован во многих тропических и субтропических странах. Он распространен фактически по всей территории США и Канады, в некоторых странах Европы. Анаплазмоз КРС является эндемичным для Мексики, Центральной и Южной Америки, Карибских островов, Африки и Азии. В Европе А. marginale встречается главным образом в Средиземноморских странах [7]. Это заболевание регистрируют в Украине, Белоруссии, Молдавии, Казахстане, государствах Средней Азии и Закавказья [2].
Согласно ветеринарной отчетности в РФ неблагополучными по анаплазмозу являются субъекты Центрального, Северо-Западного и Приволжского ФО [4].
На сегодняшний день для диагностики анаплазмоза применяют микроскопические и серологические методы исследования, однако их чувствительность и специфичность недостаточно высоки. Результаты микроскопических исследований мазков крови ненадежны на ранних стадиях инфицирования и в случаях заболеваний, сопровождающихся тяжелой формой анемии [12]. Серологические методы, основанные на использовании антител к антигенам возбудителя анаплазмоза, имеют недостаточно высокую чувствительность [13] и не позволяют дифференцировать А. marginale от других видов анаплазм [14, 16]. Наиболее оперативную и точную диагностическую информацию позволяет получить выявление ДНК возбудителей анаплазмоза в крови КРС с помощью полимеразной цепной реакции. Преимуществом ПЦР-диагностики является высокая чувствительность и специфичность – она позволяет обнаружить возбудителя на самых ранних стадиях заболевания, в том числе и во время латентной стадии, и надежно дифференцировать анаплазмоз от ряда сходных по клиническим проявлениям заболеваний.
Целью настоящих исследований была разработка способа выявления ДНК A. marginale в периферической крови крупного рогатого скота методом ПЦР.
Материалы и методы
Выделение ДНК. Пробы крови отбирали из хвостовой вены стерильными катетерами с использованием ЭДТА в качестве антикоагулянта. ДНК выделяли с помощью набора Sorb-M (Синтол, Россия) согласно рекомендациям производителя.
Конструирование праймеров для ПЦР.Для анализа гена msp4 были использованы соответствующие последовательности, принадлежащие разным изолятам A. marginale доступные в базе данных GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Выявление консервативных участков последовательностей для подбора праймеров проводили с помощью сервера СlustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Видоспецифичность праймеров была проверена с использованием алгоритма BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Визуализацию результатов проводили с помощью программы GeneDoc.
Проведение ПЦР. Реакцию амплификации проводили в 10 мкл смеси для ПЦР, содержащей 1×буфер для амплификации, 1 а. е. HS Таq ДНК-полимеразы (Евроген, Россия), 200 мкМ нуклеозидтрифосфатов, 0,2 мкМ праймера MSP4-F: 5′- AAGGGGGAGTAATGGGAGGTA -3′, 0,2 мкМ праймера MSP4-R: 5′-GGCACACTCACATCAATC -3′, 3 мкл ДНК. ПЦР проводили при следующих условиях: начальная денатурация в течение 3 мин при 95 °С; 45 циклов (15 с при 95 °С, 15 с при 58 °С, 15 с при 72 °С); финальная элонгация при 72 °С в течение 3 мин. ПЦР проводили в термоциклерах LightCycler 96 System (Roche, Швейцария) и Nyx Technik Amplitronyx 6 (США).
Электрофорез. Результаты ПЦР оценивали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Электрофорез проводили в 1xTAE буфере, содержащем раствор бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл. Электрофорез проводили в течение 40 мин при напряженности поля 5 В/см. Визуализацию результатов проводили с помощью трансиллюминатора ECX-F20.M (Vilber Lourmat, Франция).
Получение контрольной плазмиды pGEM-msp4. Полученные в результате ПЦР фрагменты гена msp4 были очищены с помощью набора GeneJET PCR Purification Kit (Life technologies, USA), лигированы в вектор pGEM-T (Promega, США) и клонированы в клетках E. coli DH5α. Трансформацию проводили методом теплового шока. Поиск колоний E. coli DH5α, содержащих плазмиду pGEM-msp4, проводили методом ПЦР с использованием стандартных праймеров M13 с последующим анализом результатов ПЦР методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Целевые колонии наращивали в течение ночи при 37 °С в 2 мл среды LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Очистку плазмидной ДНК проводили с использованием набора GeneJET Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific, США), оценку концентрации плазмидной ДНК – с помощью набора PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием флуориметра QuantiFluor-ST (Promega, США).
Секвенирование. Секвенирование полученных плазмид pGEM-msp4 осуществляли по методу Сэнгера с использованием набора ABI Prism Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям изготовителя и генетического анализатора Applied Biosystems 3130 (Life Technologies, США).
Результаты и обсуждение
Своевременная диагностика играет решающую роль в предотвращении распространения инфекционных заболеваний. ПЦР является широко используемым методом диагностики инфекционных заболеваний благодаря его высокой чувствительности, специфичности, воспроизводимости и относительной быстроте проведения анализа. Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения животных (OIE, the World Organisation for Animal Health), изложенным в «Руководстве по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных 2015 г.» (http://www.oie.int/en/international-standard-setting/terrestrial-manual/access-online/), ПЦР-диагностику A. marginale следует применять перед каждым перемещением животного на новое место и для подтверждения диагноза. На сегодняшний день описаны разные методы ПЦР для детекции A. marginale [6, 8, 9, 11, 15], однако ни один из них не прошел полную валидацию.
В данном исследовании были разработаны праймеры для амплификации фрагмента гена msp4 методом ПЦР с целью выявления А. marginale в крови КРС. Msp4 является иммунодоминантным белком наружной мембраны [7]. С целью подбора праймеров для msp4-ПЦР были проанализированы имеющиеся в международной базе данных Генбанк последовательности гена msp4 А. marginale. Сравнительный анализ последовательностей msp4 показал высокую степень их идентичности – 98–100 %. Прямой и обратный праймеры были подобраны на участки гена msp4, имеющие идентичность 100 % у всех известных изолятов А. marginale.
Видоспецифичность праймеров MSP4-F и MSP4-R была проверена in silico путем сравнения их последовательностей с геномными библиотеками с использованием программы BLASTN. В результате 100 % покрытия и идентичности последовательностей праймеров было получено со всеми последовательностями гена msp4 A. marginale, имеющимися в базе данных Генбанк. Полная комплементарность праймеров к участкам генома каких-либо нецелевых организмов не выявлена.
Подобранные праймеры MSP4-F и MSP4-R были использованы для проведения ПЦР, в которой в качестве матрицы использовалась ДНК коровы, инфицированной A. marginale по результатам проведенного нами ранее пиросеквенирования фрагментов генома голштинизированного скота [3]. В результате ПЦР был получен фрагмент ДНК длиной 157 п. н. Для подтверждения амплификации фрагмента целевого гена полученный фрагмент ДНК был лигирован в вектор pGEM-T (Promega, США) и клонирован в клетках E. coli DH5α. Выделенные плазмиды были секвенированы по методу Сэнгера. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей с помощью программы BLAST показал, что они имеют 99–100 % идентичности с фрагментом гена msp4 разных изолятов A. marginale.
Для испытания аналитической специфичности праймеров использовали образцы ДНК КРС, содержащие ДНК бактерий-симбионтов или патогенов – Sanguibacter keddieii, Propionibacterium acnes, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, а такжеобразцы ДНК овец, зараженных риккетсиями A. ovis. Анализ результатов ПЦР методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле показал отсутствие характерного для A. marginale фрагмента ДНК длиной 157 п. н., что свидетельствует об аналитической специфичности ПЦР с праймерами MSP4-F и MSP4-R.
Для определения аналитической чувствительности ПЦР была выполнена серия десятикратных разведений плазмиды pGEM-msp4, содержащей фрагмент гена msp4 длиной 157 п. н., и получены образцы, содержащие 107−100 копий гена msp4. В результате чувствительность ПЦР позволила выявить 100 копий гена msp4 и выше (рис. 1).
Для определения повторяемости и воспроизводимости метода образцы, содержащие 102−107 копий гена msp4, были проанализированы в шести повторностях. При испытании воспроизводимости амплификация проводилась разными специалистами в разные дни и на разных амплификаторах. В результате воспроизводимость и повторяемость метода составила 100 %.
Рис. 1. Результат амплификации 1000 копий (1–3), 100 копий (4–6), 10 копий (7–9) и 1 копии (10–12) плазмиды pGEM-msp4 (M – маркер молекулярного веса MWM-100RL)
Разработанный нами метод выявления A. marginale был апробирован на образцах ДНК, выделенной из цельной крови коров. Исследование проводили в трех повторностях. В качестве внутреннего положительного контроля, позволяющего оценить корректность постановки реакции и отсутствие ингибиторов, использовали плазмиду pGEM-msp4. В качестве отрицательного контроля использовали образец, не содержащий ДНК. Результаты исследования показаны на рисунке 2.
Рис. 2. Результат амплификации ДНК, выделенной из цельной крови инфицированных (1–3) и неинфицированных (4) животных, с помощью праймеров MSP4-F и MSP4-R:
«К+» − положительный контроль; «K−» − отрицательный контроль, M − маркер молекулярной массы
Заключение
Таким образом, нами разработан и апробирован метод ДНК-диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота. Чувствительность метода позволяет выявить 100 копий гена msp4 A. marginale и выше. Проведенные испытания свидетельствуют о 100%-ной повторяемости и воспроизводимости данного метода.
1. Василевич Ф. И., Белименко В. В., Гулюкин М. И., Георгиу Х. Практическое руководство по борьбе с кровепаразитарными болезнями домашних животных. - Москва: ЗооВетКнига, 2015. - 86 с.
2. Георгиу Х., Белименко В. В. Современные лабораторные методы диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота и овец // РВЖ. СХЖ. - 2014. - № 3. - С. 31-32.
3. Глазко В. И., Косовский Г. Ю., Ковальчук С. Н. и др. Инвертированный повтор микросателлита (AGC)6G фланкирует районы ДНК с участками гомологии к ретротранспозонам в геноме крупного рогатого скота // Инновационные технологии в медицине. - 2014. - № 2, Т. 3. - С. 63-79.
4. Гулюкин М. И., Заблоцкий В. Т., Белименко В. В. Мониторинг эпизоотической ситуации по протозойным кровепаразитарным болезням домашних животных в Российской Федерации (2007-2012) // РВЖ. СХЖ. - 2013. - № 2. - С. 36-40.
5. Гулюкин М. И., Заблоцкий В. Т., Белименко В. В. и др. Кровепаразитарные болезни домашних животных (Атлас). - Москва: ЗооВетКнига, 2013. - 86 с.
6. Carelli G., Decaro N., Lorusso A. et al. Detection and quantification of Anaplasma marginale DNA in blood samples of cattle by real-time PCR // Vet. Microbiol. - 2007. - Vol. 124. - P. 107-114.
7. de la Fuente J., Lew A., Lutz H. et al.Genetic diversity of Anaplasma species major surface proteins and implications for anaplasmosis serodiagnosis and vaccine development // Anim. Health Res. Rev. - 2005. - Vol. 6. - P. 75-89.
8. de la Fuente J., Van Den Bussche R. A., Kocan K. M. Molecular phylogeny and biogeography of North American isolates of Anaplasma marginale (Rickettsiaceae: Ehrlichieae) // Vet Parasitol. - 2001. - Vol. 97. - P. 65-76.
9. Fyumagwa R. D., Simmler P., Meli M. L. et al. Prevalence of Anaplasma marginale in different tick species from Ngorongoro Crater, Tanzania // Vet Parasitol. - 2009. - Vol. 161, № 1-2. - P. 154-157.
10. Kocan K. M., de la Fuente J., Blouin E. F. et al. The natural history of Anaplasma marginale // Vet. Parasitol. - 2010. - Vol. 167. - P. 95-107.
11. Potgieter F. T., Stoltsz W. H. Anaplasmosis // Infectious Diseases of Livestock With Special Reference to Southern Africa. - 1994. - P. 408-430.
12. Reinbold J. B., Coetzee J. F., Sirigireddy K. R., Ganta R. R. Detection of Anaplasma marginale and A. phagocytophilum in Bovine Peripheral Blood Samples by Duplex Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assay // Journal of clinical microbiology. - 2010. - Vol. 48, № 7. - P. 2424-2432.
13. Strik N. I., Alleman A. R., Barbet A. F. et al. Characterization of Anaplasma phagocytophilum major surface protein 5 and the extent of its cross-reactivity with A. marginale // Clin. Vaccine Immunol. - 2007. - Vol. 14. - P. 262-268.
14. Torina A., Agnone A., Blanda V. et al. Development and validation of two PCR tests for the detection of and differentiation between Anaplasma ovis and Anaplasma marginale // Ticks Tick Borne Dis. - 2012. - Vol. 3, № 5-6. - P. 283-287.
15. Visser E. S., McGuire T. C., Palmer G. H. et al. The Anaplasma marginale msp5 gene encodes a 19-kilodalton protein conserved in all recognized Anaplasma species // Infect Immun. - 1992. - Vol. 60, № 12. - P. 5139-5144.
