Воронеж, Россия
Россия
с 01.01.2018 по 01.01.2025
Россия
Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС» (старший научный сотрудник)
Тамбов, Тамбовская область, Россия
Одной из основных трудностей, препятствующих повсеместному внедрению технологии клонального микроразмножения для получения качественного посадочного материала древесных растений, является слож-ность получения асептически чистой культуры с высокой регенерационной способностью. В статье обсужда-ются эффекты воздействия растворов наночастиц CuO (75-100 нм), стабилизированных поверхностно актив-ными веществами (Твин 20, Тритон Х100 и Полигексаметиленбигуанид), на этапе введения в культуру in vitro гибрида Т. белый × осина и березы пушистой 15-1. Предполагается, что внесение наночастиц в состав пита-тельной среды Мурасиге-Скуга позволит снизить микробную нагрузку эксплантов, а также усилит рост и мор-фогенез растений. Использование растворов наночастиц не отменяет использование традиционных методов стерилизации эксплантов, а служит дополнительной мерой. В ходе проведения исследований определена оп-тимальная концентрация наночастиц – 5 мг/л, использование которой в составе среды культивирования позво-ляет повысить выход стерильных жизнеспособных эксплантов тополя на 16,7-26,7%, березы 30,0-36,7%. Уста-новлено, что наибольшем антагонистическим действием в отношении поверхностной (эпифитной) микрофлоры обладают наночастицы, стабилизированные Полигексаметиленбигуанидом – выход микропобегов тополя и березы, пригодных для проведения дальнейших этапов микроразмножения составляет 66,7%. Использование данной комбинации наночастиц позволяет получить минимальное количество нежизнеспособных культур. Повышение показателя асептически жизнеспособных эксплантов с применением растворов наночастиц оксида меди положительно сказывается на эффективности клонального микроразмножения за счет ускорения процес-са микроклонирования, сокращения времени получения готового посадочного материала, улучшения качества продукта.
клональное микроразмножение, гибрид Т. белый × осина, береза пушистая 15-1, наночастицы, оксид меди, стабилизаторы, Твин 20, Тритон Х100, полигексаметиленбигуанид (ПГМБ), экспланты
Введение
Клональное микроразмножение древесных культур в настоящее время остаётся важным инструментом для массового выращивания генетически стабильного посадочного материала, свободного от вредителей и болезней [1-3]. В некоторых случаях это единственный способ сохранить и повысить экономическую ценность определённых генетически ценных культур. Несмотря на то, что методика клонирования с помощью органов, клеток, тканей и клеточных культур нашла широкое применение, для многих видов растений она крайне затруднена. Одной из очевидных причин являются сложности получения хорошо растущей культуры, свободной от контаминирующих агентов - микроорганизмов. Поскольку питательная среда для in vitro выращивания растений содержит нутриенты, пригодные для роста и развития микроорганизмов, проблема стерильности сред и растительных эксплантов в биотехнологических лабораториях стоит достаточно остро [4]. Поверхностные ткани органов растений инфицированы бактериями, грибами и их спорами. В связи с этим первым шагом для получения изолированных клеток, тканей и органов растений является стерилизация растительного материала. Перед стерилизацией объекта его тщательно моют теплой водой с мылом, промывают дистиллированной водой. Для стерилизации используют широкий спектр разных стерилизующих веществ: хлорамин, коммерческий препарат «Белизна», перекись водорода, ртутные препараты (сулема), перманганат калия [5]. Правильный выбор стерилизующего вещества заключается в том, чтоб нейтрализовать микроорганизмы, которые обитают на поверхности надземных частей растений (эпифитная микрофлора) и не повредить ткани растения. Кроме того, вещество не должно глубоко проникать в ткань и легко вымываться. Стерилизующие растворы необходимо применять в строго определенной концентрации, чтобы не вызвать некроза тканей у молодых побегов растений [6]. Применение стерилизующих агентов бывает порой недостаточной и действенной мерой по преодолению эндогенной инфекции. Многие специалисты широко используют антибиотики несмотря на то, что они не только губительно действуют на микроорганизмы, но и могут угнетать дифференциацию тканей растения [7]. Добавление в питательные среды антибиотиков зачастую приводит к резкому ухудшению приживаемости эксплантов, снижению показателей роста и развития размножаемых растений [8]. Кроме того, антибиотические вещества, активные в подавлении роста бактериальных культур, не действуют на грибную микрофлору. Поражение же грибковой инфекцией при введении в культуру in vitro встречается чаще, чем бактериальной. Это можно объяснить тем, что грибы менее требовательны к среде поскольку группы ферментов, которые они выделяют способствуют усвоению питательных веществ практически из любого субстрата, бактерии в этом отношении более требовательны и предпочитают расти на средах с большим содержанием органических веществ. Имеются работы [9] по использованию медицинских противогрибковых препаратов (нистатин, гризеофульвин и др.) в составе питательных сред, однако их эффективность была недостаточной.
В этой связи поиски средств, которые бы оказывали прямое антагонистическое воздействие на процессы роста и развития микроорганизмов, составляющих основную эпифитную микрофлору вводимых культур являются актуальными.
В последнее десятилетие нанотехнологии и наноматериалы стали неотъемлемой частью современного агротехнологического процесса. Наночастицы (НЧ) металлов широко используются в сельском хозяйстве в виде микроудобрений, детекторов патогенов, фунгицидов [10, 11, 12] и пр. Металлы в форме НЧ обеспечивают более высокую проникающую способность по сравнению с более крупными частицами, обладают уникальными функциональными возможностями, электрическими и оптическими свойствами, высокой стабильностью и высокой адсорбционной способностью, что делает их перспективной формой для обеспечения растений микроэлементами [13]. Кроме того, некоторые НЧ, такие как НЧ серебра и меди обладают хорошими дезинфицирующими свойствами для эксплантов и питательных сред [14, 15].
Медь относится к группе тяжелых металлов и при этом является жизненно важным элементом, поскольку является неотъемлемой частью биохимических и физиологических процессов, протекающих в тканях растений, включая фотосинтез, дыхание, водный обмен, метаболизм белкой и углеводов, а также влияет на устойчивость к грибным и бактериальным заболеваниям. Считается, что примерно 5-30 мг/кг меди является достаточным количеством в тканях растений для их правильного роста и развития [16, 17].
Из-за значительного фунгицидного потенциала наночастиц и наноматериалов исследования их возможного использования в устойчивом сельском хозяйстве в качестве альтернатив химическим фунгицидам быстро продвигаются вперед. Имеется ряд работ, показывающих, что НЧ CuO и Cu2O могут применяться не только на стадии стерилизации эксплантов, но и в качестве фунгицидов для защиты от патогенов на разных стадиях роста и развития растений [18, 19, 20]. Так, было показано, что НЧ Cu2O в концентрациях 10-100 мкг/л ингибировали рост мицелия Fusarium solani в лабораторных условиях, а также снижали заболеваемость корневой гнилью огурцов в тепличных и полевых условиях. Они также улучшали рост и производственные характеристики огурцов, повышая активность защитных ферментов. Анатомические исследования выявили лизис мицелия, уменьшение спор и гибель Fusarium solani, а также увеличение толщины клеточной стенки тканей корня и мезофильной ткани растений огурцов [21]. Смеси НЧ Cu/Cu2O в концентрациях 0,1-0,5 г/л показали высокую фунгицидную активность по отношению к Fusarium oxysporum in vitro, вызывая ингибирование радиального роста колонии. Наибольшая эффективность показана в смеси с высоким процентом Cu2O [22]. Кроме того, применение НЧ Cu2O/Cu в концентрации 0,1 г/л эффективно ингибирует рост колоний таких фитопатогенных грибов, как Fusarium oxysporum, Fusarium solani и Colletotrichum gloeosporioides. Результаты показали ингибирование до 96% для Fusarium oxysporum, 74% для Fusarium solani и 89% для Colletotrichum gloeosporioides. В качестве механизма действия авторы предполагают выработку внутриклеточных активных форм кислорода, приводящих к низкой жизнеспособности спор [23].
Hao Y. И др. [24] в своей работе исследовали влияние сферических НЧ CuO размером 20-30 нм на возбудителя серой гнили многих растений – штамм Botrytis cinerea в экспериментах in vitro. Результаты показывают уменьшение диаметра мицелия гриба при добавлении НЧ CuO в концентрациях 50-200 мг/л. Причем наиболее эффективной оказалась концентрация 50 мг/л, обработка которой привела к уменьшению диаметра мицелия на 18%.
При разработке препаратов на основе металлических НЧ важным вопросом остается выбор стабилизатора, введение которого в процессе синтеза обеспечивает сохранение структур в наноразмерном диапазоне, а, следовательно, и их основных характеристик, в том числе антимикробных свойств.
Целью настоящего исследования является установление возможности использования НЧ CuO, стабилизированных поверхностно-активными веществами (ПАВ) (Твин 20, Тритон Х100 и Полигексаметиленбигуанид (ПГМБ)), в составе питательной среды. Предполагается, что модификация питательной среды будет способствовать снижению уровня контаминирования эксплантов и повышению их морфогенного потенциала.
