Objective of research: conducting morphological and molecular-genetic identification and studying phylogenetic relations between protostrongylids. Materials and methods: helminthological material was collected from wild (Capra sibirica, C. falconeri, Ovis vignei and O. ammon) and domestic hollow horned ruminants (C. hircus and O. aries), and land mollusks of the family Xeropicta in the piedmont and mountain area of Uzbekisan. The morphology of protostrongylids was studied using the methods of Boev (1975) and Anderson (1978). To identify the nematode type we used temporary preparations treated with glycerol. The first-stage larvae were investigated by examination of fecal samples from animals taking into account the length, tail form and body size. To study the morphology of the third-stage protostrongylid larvae the feet of infected mollusks Xeropicta candaсharica were separated and placed into the artificial gastric juice where the cap was destroyed and the infected larvae were eliminated. After determination of species belonging of mature and larval nematodes the material was stored in separate test-tubes with distilled water under the low temperature (- 20 ºС) or in 70 % Ethanol for the molecular analysis. We used microscopes ML 2000 with a digital camera and Olympus CX3. DNA extraction, amplification and sequencing were performed with an automated sequencer. Phylogenetic analysis was conducted using the software Clustal X 2.0. Phylogenetic trees were created by the Neighbor–Joining method. Nucleotide sequences ITS-2 regions of species Protostrongylus rufescens (EU018485), P. shiozawai (AB478249), Ortostrongylus macrotis (EU018483), Cystocaulus ocreatus (EU018481) and Umingmakstrongylus pallikuukensis (AY648409) received from the NCBI GenBank were used in phylogenetic analysis. Results and discussion: Four species of adult protostrongylid nematodes: Protostrongylus rufescens, P. hobmaieri, Spiculocaulus leuckarti and Cystocaulus ocreatus were determined. DNA from four species of mature protostrongylids and larvae was amplified by using ITS-2 regions. Amplificate dimension of nematodes P. rufescens and P. hobmaieri was 380 base pairs (b.p.), S. leuckarti – 388, C. ocreatus – 399 b.p. According to the results of phylogenetic analysis and comparison of nucleotide sequences, five protostrongylid species were found in animals of the Caprinae subfamily: P. rufescens, P. hobmaieri, Protostrongylus sp., S. leuckarti and C. ocreatus. The morphological and molecular-genetic analysis of detected nematodes enables the precise identification.
Protostrongylidae, hollow-horned, mollusks, DNA, ITS-2, nucleotide sequence.
Цель исследования — проведение морфологической и молекулярно-генетической идентификации и изучение филогенетической взаимосвязи среди видов протостронгилид.
Материалы и методы. Гельминтологический материал собирали от диких и домашних полорогих и наземных моллюсков рода Xeropicta в предгорно-горных зонах Узбекистана. Морфологию протостронгилид изучали методами Боева (1975) и Anderson (1978). Для определения вида нематод готовили временные препараты, обработанные глицерином. Личинок первой стадии изучали путем исследования проб фекалий животных с учетом длины, формы хвоста и размера тела. Для изучения морфологии личинок третьей стадии протостронгилид отделяли ножки у зараженных моллюсков Xeropicta candaсharica и помещали их в искусственный желудочный сок, где разрушался чехлик и освобождались инвазионные личинки. После определения видовой принадлежности половозрелых и личиночных стадий нематод материал хранили в отдельных пробирках с дистиллированной водой при низких температурах (- 20 ºС) или в 70%-ном этаноле для молекулярного анализа. В работе использованы микроскопы ML 2000 с цифровой камерой и Olympus CX31. Выделение ДНК, амплификацию и секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе. Филогенетический анализ проводили при помощи програмного обеспечения ClustalX 2.0. Филогенетические деревья построены при помощи метода присоединения соседей NJ (Neighbor–Joining method). Для сравнения филогенетического анализа использованы нуклеотидные последовательности ITS-2 участка видов Protostrongylus rufescens (EU018485), P. shiozawai (AB478249), Ortostrongylus macrotis (EU018483), Cystocaulus ocreatus (EU018481) и Umingmakstrongylus pallikuukensis (AY648409), которые получены из Генбанка (NCBI GenBank).
Результаты и обсуждение. Обнаружены половозрелые нематоды четырех видов протостронгилид: Protostrongylus rufescens, P. hobmaieri, Spiculocaulus leuckarti и Cystocaulus ocreatus. ДНК четырех видов половозрелых протостронгилид и личинок была амплифицирована с использованием ITS-2 региона. Размер амплификатов у нематоды P. rufescens и P. hobmaieri составил 380 пар нуклеотидов (п. н.), S. leuckarti – 388, C. ocreatus – 399. По результатам филогенетического анализа и сравнения нуклеотидных последовательностей у Caprinae выявлено 5 видов протостронгилид: Protostrongylus rufescens, P. hobmaieri, Protostrongylus sp., Spiculocaulus leuckarti и Cystocaulus ocreatus. Морфологический и молекулярно-генетический анализ выявленных нематод позволяет провести их точную идентификацию. Ключевые слова: Protostrongylidae, полорогие, моллюски, DNA, ITS-2, нуклеотидная последовательность. Введение Нематоды семейства Protostrongylidae Leiper, 1926 – своеобразная группа нематод, паразитов респираторной системы жвачных и зайцеобразных. В семействе протостронгилид к настоящему времени описано 60 видов, отдельные популяции которых зарегистрированы в Европе, Азии, Америке, Африке и Австралии [1–7]. В Узбекистане у полорогих зарегистрировано 15 видов паразитов [2–4]. В биологическом отношении нематоды семейства Protostrongylidae занимают особое положение среди родственных групп. Они в процессе эволюции на всех стадиях своего развития перешли к обитанию в условиях суши. Половозрелые нематоды паразитируют у наземных млекопитающих, а личинки развиваются в наземных моллюсках, выполняющих роль промежуточных хозяев. В организме этих моллюсков, развиваются личинки второй и третьей стадий [2, 3]. Данные по молекулярному анализу нематод этой группы ограничены. В частности, убедительных фактов, касающихся частичных последовательностей из малой и большой субъединицы рибосомальной ДНК у Protostrongylidae, не обнаружено [8]. Посредством ограниченного анализа последовательностей рибосомальных ДНК 18S и 28S, выделенных из представителей таксонов Strongylida, были выведены различия в монофилии протостронгилид внутри Metastrongylina [9]. Проведены анализы на более низких таксономических уровнях, исследующие как ядерные, так и митохондриальные локусы или конформационный полиморфизм. Уделялось внимание разработке диагностики применения в географически экстенсивных регионах [9–11] или оценке генетического разнообразия видов и популяций [12, 13]. На основе сравнений и сходства последовательностей второго внутреннего транскрибирующего спейсера (ITS-2) были идентифицированы виды 7 родов протостронгилид, эндемичных для Северной Америки [11]. Дифференцированный анализ с использованием молекулярных маркеров (ядерных и митохондриальных) является крайне важным вкладом в изучении полевых коллекций взрослых паразитов и личинок. Корреляция молекулярных последовательностей между взрослыми (подтвержденной сравнительной морфологией) и личиночными стадиями паразитов приведет к первоначальной точной идентификации видов рода Protostrongylus и других протостронгилид. К настоящему времени не удалось обнаружить достоверных диагностических морфологических признаков сходства в строении личинок первой стадии (L1 - в фекалиях и окружающей среде) и личинок второй и третьей стадий (L2, L3 – в промежуточном хозяине) [3, 11]. Целью наших исследований было проведение морфологической и молекулярно-генетической идентификации и изучение филогенетической взаимосвязи среди видов протостронгилид
1. Azimov D. A., Akramova F. A., Husanov A., Kuchboev A. E. Structure and functioning of nematodes of the family Protostrongylidae Leiper,1926. Dokl. AN RUz. [Proc. of Academy of Sciences of the Republic of Uzbekistan]. Tashkent, 1998, no. 10, pp. 39-41.
2. Boev S. N. Osnovy nematodologii. Protostrongilidy [Essentials of Nematodology. Protostrongylids]. Moscow, Nauka, 1975, vol. 25. 266 p.
3. Kontrimavichus V. L., Delyamure S. L., Boev S. N. Osnovy nematodologii. Metastrongiloidei domashnih i dikih zhivotnyh. [Essentials of Nematodology. Metastrongylidae in domestic and wild animals.]. Moscow, Nauka, 1976, vol. 26. 239 p.
4. Kulmamatov E. N., Isakova D. T., Azimov D. A. Gel´minty pozvonochnyh gornyh ekosistem Uzbekistana [Helminthes in vertebrates of mountain ecosystems of Uzbekistan]. Tashkent, Fan, 1994. 151 p.
5. Kuchboev A. E. Populyatsionnaya ekologiya, sistematika nematod semeistva Protostrongylidae Leiper, 1926 i funktsional´no-metabolicheskiye processy v sisteme «parazit-hozyain»: Avtoref. dis... d-ra biol. nauk. [Population ecology, systematics of the nematode family Protostrongylidae Leiper, 1926, functional and metabolic processes in host - parasite relationship. Abst. doct. diss... biol.sc.].Tashkent, 2009. 43 p.
6. Ruziev B. H. Associativnaya invaziya protostrongilidami ovets i morfo-funktsional´nye vzaimootnosheniya v sisteme «parazit-hozyain»: Avtoref. dis. … kand. biol. nauk. [Associative protostrongylid infection in sheep, and morphological and functional relationship of “host - parasite” system. Abst. Phd diss... biol. sc.]. Tashkent, 2008. 21 p.
7. Anderson R. C., Chabaud A. G., Willmott S. Key to genera of the superfamily Metastrongyloidea. No. 5. CIH Keys to the nematode parasites of vertebrates. - Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, UK, 1978, pp. 1-40.
8. Carreno R. A., Nadler S. A. Phylogenetic analysis of the Metastrongyloidea (Nematoda: Strongylida) inferred from ribosomal RNA gene sequences. J. of Parasitology, 2003, vol. 89, pp. 965-973.
9. Chilton N. B., Huby-Chilton F., Gasser R. B., Beveridge I. The evolutionary origins of nematodes within the order Strongylida related to predilection sites within hosts. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2006, vol. 40, pp. 118-128.
10. Jenkins E. J., Appleyard G. D., Hoberg E. P. et al. Geographic distribution of the muscle-dwelling nematode Parelaphostrongylus odocoilei in North America, using molecular identification of first stage larvae. J. of Parasitology, 2005, vol. 91, pp. 574-584.
11. Kutz S. J., Asmundsson I., Hoberg E. P. et al. Veitch ASerendipitous discovery of a novel protostrongylid (Nematoda: Metastrongyloidea) in caribou (Rangifer tarandus), muskoxen (Ovibos moschatus) and moose (Alces alces) from high latitudes of North America based on DNA sequence comparisons. Canadian J. of Zoology, 2007, vol. 85, pp. 1143-1156.
12. Mortenson J. A., Abrams A., Rosenthal B. et al. Parelaphostrongylus odocoilei in Columbian black-tailed deer from Oregon. J. of Wildlife Diseases, 2006. vol. 42, pp. 527-535.
13. Asmundsson I., Mortenson J., Hoberg E. P. Muscleworms, Parelaphostrongylus andersoni (Nematoda: Protostrongylidae), discovered in Columbia white-tailed deer from Oregon and Washington: Implications for biogeography and host associations. J. of Wildlife Disease, 2008, vol. 44, pp. 16-27.
14. Larkin M. A., Blackshields G., Brown N. P. et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 2007, vol. 23, pp. 2947-2948.
