IMPROVEMENT OF CLONAL MICROPROPAGATION OF BERRY CROPS
Abstract and keywords
Abstract (English):
The aim of the study is to optimize the conditions for in vitro cultivation of blue honeysuckle, raspberry and strawberry. The work was carried out in 2012-2020. The Murasige-Skuga medium (1/2 MS) was the control for all cultures for the initiation of explants. Additionally, we used a modified nutrient medium 1/2 MS with a reduced NH4 content by 15 % compared to the base MS; and Woodi Plant Medium (1/2 WPM) for honeysuckle; for raspberries - Quoirin-Lepoivre (1/2 QL) and 1/2 Anderson; for strawberries - 1/2 MS. For micropropagation and rooting, the following media were used: honeysuckle - modified MS and WPM; raspberries - QL and Anderson; strawberries - MS modified by Siliplant and Boksyu; control for all - MS. The following growth regulators were added to the optimal each culture a nutrient medium: 6-benzylaminopurine (6-BAP), gibberellic acid (GA), waste products of the large wax moth larvae, indolyl-3-butyric acid (IBA), Siliplant, EcoFus, HB-101. The effect of LED-phytoirradiators with a combination of red, blue and white light in the spectrum 2: 1: 1, 1: 1: 1, 2: 1, respectively, and LED-irradiators with a changing spectrum and flashing were studied at the stages of micropropagation and rooting in all cultures. The survival rate of honeysuckle explants on 1/2 WPM medium was 62.2 % (control 27.9 %). The highest reproduction factor of 5.1 (control 2.6) was achieved when using LED 2 red : 1 blue : 1 white on MS modified + 6-BAP 1.0 mg/L + kinetin 0.5 mg/L, and high rooting rate of honeysuckle 89.0 % (76.0 % k) was achieved on MS modified + IBA 0.5 mg/L. Cultivation of red raspberries on QL + 6-BAP 1.0 mg/L + GA 0.5 mg/L and LED irradiation 2 red : 1 blue : 1 white provided a reproduction factor of 5.3 (control 2.7), addition of IBA 0.5 mg/L + HB-101 100 μL/L in QL and LED irradiation 1 red : 1 blue : 1 white contributed to 100 % rooting. The addition of 6-BAP 1.0 mg/L + IBA 0.2 mg/L + GA 0.5 mg/L in QL and LED lighting 1 red : 1 blue : 1 white increased the reproduction factor of remontant raspberries by 1.6 times (from 2, 6 to 4.1), and the use of QL + IBA 0.5 mg/L + HB-101 50 μL/L and LED 2 red : 1 blue : 1 white increased its rooting ability to 96 % (control 67 %). LED irradiation with a changing spectrum during cultivation of garden strawberries on MS + Siliplant + EcoFus at 0.5 ml/L provided a reproduction factor of 5.9 (control 3.8), and the reproduction factor of remontant strawberries on MS + HB-101 100 μl/L was 7.4 (control 5.6). The addition of IBA 0.5 mg/L + HB-101 100 μL/L to the MS promoted the rooting of garden strawberries of 100 % when using a LED irradiator with a changing spectrum, and remontant strawberries – with a blinking LED irradiator

Keywords:
Honeysuckle blue (Lonicera caerulea), raspberry ordinary (Rubus idaeus), strawberry garden (Fragaria ananassa), clonal micropropagation, LED phytoirradiator
Text
Publication text (PDF): Read Download

Клональное микроразмножение ягодных и других растений – наиболее надежный и перспективный метод, позволяющий производить посадочный материал, свободный от различных заболеваний [1]. Работу в лабораторных условиях осуществляют круглый год, нужную партию растений можно сформировать к определенному сроку, иногда за очень короткий промежуток времени [2].

Оптимальная питательная среда, регуляторы роста и спектральный состав света – самые важные факторы биопродуктивности растений in vitro [3].

При производстве посадочного материала метод клонального микроразмножения дает ряд преимуществ, по сравнению с традиционным черенкованием и прививкой, поэтому также очень важен вопрос экономической эффективности [4].

Цель исследований – совершенствование биотехнологических методов выращивания жимолости синей, малины и земляники.

Условия, материалы и методы. Эксперименты проводили в 2012–2020 гг. согласно методическим указаниям «Технологический процесс получения оздоровленного от вирусов посадочного материала плодовых и ягодных культур» (2013) и ГОСТ Р 54051-2010 «Плодовые и ягодные культуры. Стерильные культуры и адаптированные микрорастения. Технические условия».

Объектами служили: на этапе введения в культуру ткани – инициальные экспланты, на этапе собственно микроразмножения – микрочеренки, на этапе адаптации – микрорастения жимолости синей, малины красной и ремонтантной, земляники садовой и ремонтантной.

На этапе введения в стерильную культуру для всех культур использовали питательные среды с половинной дозой макро- и микросолей, контрольной была среда Мурасиге-Скуга (1/2МС). Дополнительно изучали возможность использования для жимолости 1/2 МС модифицированную с уменьшенным на 15 %, по сравнению с базовой МС, содержанием аммиачного азота NH4 и Woodi Plant Medium (1/2 WPM); для малины – Quoirin-Lepoivre (1/2 QL) и 1/2 Андерсона. Для земляники на этом этапе другие питательные среды не использовали.

Стерилизовали экспланты 33 %-ным раствором пергидроли.

На этапах собственно микроразмножения (5 пассажей) и укоренения использовали следующие питательные среды: для жимолости –

МС модифицированная, WPM; для малины – QL, Андерсона; для земляники – МС модифицированная Силиплантом, Боксю; контрольной для всех культур служила среда МС. В оптимально выделившуюся для каждой культуры питательную среду перед автоклавированием вносили различные регуляторы роста: 6-БАП – 6-бензиламинопурин, ГК – гиббереллиновая кислота, ПЖВМ – продукты жизнедеятельности личинок большой восковой моли, ИМК – индолил-3-масляная кислота (табл. 1).

Дополнительно на этапах собственно микроразмножения и укоренения на всех культурах изучали действие светодиодных фитооблучателей (СД-облучатель) с сочетанием в спектре красного, синего и белого света соответственно 2:1:1, 1:1:1, 2:1 [6], СД-облучателей с меняющимся спектром и мигающего. Последние два фитооблучателя применяли также на этапе адаптации земляники. Контрольным был люминесцентный фитооблучатель. Фотопериод составлял 14 ч, освещенность – 75…85 мМоль/м2×сек-1, 6500 К, температура воздуха – 22…27 0С, влажность – 50…60 % [7]. Экспериментальные светодиодные фитооблучатели с различными характеристиками, которые, наряду с экономией электроэнергии, улучшают качество освещения микрорастений, разработаны в ФГБОУ «Ижевская ГСХА» [8].

На этапе адаптации использовали субстраты на основе низинного торфа и речного песка в соотношении 3:1 (контроль), низинного торфа и вермикулита 3:1, верхового торфа [9].

Препараты с фитозащитными и ростостимулирующими свойствами применяли путем опрыскивания водными растворами [10].

В каждом варианте работали с объемом выборки 10 единиц, все опыты проводили в трехкратной повторности. Экспериментальные данные обработаны методом дисперсионного анализа по Доспехову Б. А. (М., 2001).

Анализ и обсуждение результатов. На этапе введения в стерильную культуру оптимальной для всех сортов жимолости была питательная среда 1/2 WPM, обеспечившая значительное увеличение выживаемости эксплантов до 62,2 %, в сравнении с контрольной
(27,9 %). Культивирование на среде
1/2 QL повышало выживаемость апексов малины красной в 1,7 раза, ремонтантной – в 1,3 раза. Выживаемость эксплантов земляники на среде 1/2 МС составила 81,5 %, поэтому в подборе оптимальной питательной среды на этапе введения в культуру не было необходимости.

Культивирование жимолости синей на питательной среде МС модифицированной с добавлением 6-БАП 1,0 мг/л + кинетин 0,5 мг/л при освещении светодиодным фитооблучателем со спектром 2К:1С:1Б способствовало увеличению коэффициента размножения (КР), в сравнении с контролем (2,6), в 2 раза
(табл. 2).
Добавление в указанных условиях индуктора ризогенеза ИМК 0,5 мг/л обеспечило существенное увеличение укореняемости микрочеренков жимолости синей, в сравнении с контролем (76,0 %), до 89,0 %.

Культивирование малины красной на среде QL с добавлением 6-БАП 1,0 мг/л + ГК 0,5 мг/л при облучении СД 2К:1С:1Б повышало КР, в сравнении с контролем (2,7), практически в 2,0 раза (5,3). Внесение в питательную среду ГК 0,5 мг/л обеспечило увеличение высоты микрочеренков малины красной, в сравнении с контролем (1,2 см), до 1,8 см с последующей высадкой их на укоренение без этапа элонгации (удлинения). Укоренение микрочеренков малины красной на питательной среде QL с добавлением ИМК 0,5 мг/л + НВ-101 100 мкл/л и освещении СД 1К:1С:1Б обеспечило 100 %-ный результат.

Культивирование малины ремонтантной на среде QL с добавлением 6-БАП 1,0 мг/л + ИМК 0,2 мг/л + ГК 0,5 мг/л при облучении СД

1К:1С:1Б повышало КР, в сравнении с контролем (2,6), в 1,6 раза. Внесение в питательную среду ГК 0,5 мг/л обеспечило увеличение высоты микрочеренков малины ремонтантной, в сравнении с контролем (1,5 см), в среднем до 3,0 см, что позволило высадить 70 % микрочеренков на укоренение также без этапа элонгации. Значительное увеличение укореняемости малины ремонтантной (до 96 %, при 67 % в контроле) отмечали при совместном внесении в среду QL ИМК 0,5 мг/л и НВ-101 50 мкл/л при облучении СД 2К:1С:1Б.

Максимальный в опыте КР микрочеренков земляники садовой (5,9) зафиксирован на среде МС при совместном использовании Силипланта и ЭкоФуса в концентрациях 0,5 мл/л и освещении СД с меняющимся спектром, в контроле величина этого показателя была на 2,1 меньше. Сокращению этапа укоренения микрочеренков земляники садовой до 10 суток (в контроле 20 суток) и 100 %-ному укоренению способствовало добавление в питательную среду НВ-101 в концентрации 100 мкл/л и освещение светодиодным фитооблучателем с меняющимся спектром. У земляники ремонтантной самый высокий КР отмечен также на среде МС с НВ-101 в концентрации 100 мкл/л при освещении светодиодным фитооблучателем с меняющимся спектром – 7,4 (в контроле 5,6). Укореняемость микрочеренков земляники ремонтантной составила 100 % на этой же питательной среде с добавлением ИМК
0,5 мг/л и НВ-101 в концентрации 100 мкл/л, но при освещении мигающим светодиодным фитооблучателем.

Применение Рибав-Экстра и освещение светодиодным мигающим фитооблучателем активизировало ризогенез микрочеренков земляники. Укореняемость земляники садовой на уровне 100 % отмечали через 10 суток после высадки при концентрации препарата 1,5 мл/л составила, ремонтантной – через 20 суток при концентрации 1,0 мл/л. Внесение в питательную среду ПЖВМ во всех дозах также значительно увеличивало укореняемость микрочеренков: у земляники садовой она достигала 86,4…100 %, ремонтантной – 88,9…100 % [11].

К концу этапа укорененные микрочеренки жимолости синей, малины и земляники соответствовали ГОСТ Р 54051-2010.

На этапе адаптации увеличение приживаемости микрорастений жимолости до 93,4 % обеспечило использование субстрата на основе верхового торфа в сочетании с обработкой 0,01 %-ным водным раствором НВ-101. В этом варианте выход кондиционных адаптированных микрорастений жимолости достиг
91,1 % при 67,9 % в контроле.

Выход 100 % адаптированных микрорастений малины красной и ремонтантной отмечен при использовании общепринятой методики.

Адаптацию укорененных микрочеренков земляники со 100 % приживаемостью обеспечило опрыскивание 0,1 %-ным водным раствором Силипланта и обработка 0,05 % смешанным раствором Силипланта с ЭкоФусом при освещении светодиодным фитооблучателем с меняющимся спектром. Кроме того, приживаемость 100 % микрорастений земляники садовой отмечали при опрыскивании 0,4 %-ным водным раствором ПЖВМ; приживаемость 99,8 % микрорастений земляники ремонтантной наблюдали при опрыскивании 0,6 %-ным водным раствором ПЖВМ.

При соблюдении перечисленных условий к концу этапа адаптированные микрорастения

жимолости синей, малины и земляники соответствовали ГОСТ Р 54051-2010.

Подбор оптимальных питательных сред, регуляторов роста и светового режима в клональном микроразмножении жимолости синей, малины и земляники позволил значительно увеличить КР и выход адаптированных микрорастений. Результаты этих исследований легли в основу усовершенствованных методик для клонального микроразмножения изучаемых культур.

Применение улучшенной методики увеличило выход адаптированных микрорастений жимолости синей в 3,8 раза, снизило их себестоимость – на 20,6 % (табл. 3). Это позволило в конечном итоге произвести стандартный посадочный материал с закрытой корневой системой в течение одного вегетационного периода при уровне рентабельности 113,0 %, что на 32,0 % выше, чем по традиционной методике. Соблюдение усовершенствованной методики клонального микроразмножения позволило увеличить выход адаптированных микрорастений малины красной в 7,1 раза, малины ремонтантной – в 3,3 раза. Уровень рентабельности составил соответственно
155 % и 145 %. Использование усовершенствованной методики увеличило выход микрорастений земляники садовой в 2,1 раза, ремонтантной – в 1,9 раза, снизило себестоимость одного адаптированного микрорастения соответственно на 33,0 % и 52,0 %, повысило уровень рентабельности до 80,7 и 134,4 % соответственно.

Выводы. Оптимальной питательной средой для жимолости синей на этапе введения в культуру in vitro оказалась 1/2 WPM, обеспечивающая выживаемость эксплантов 62,2 %. Питательная среда МС с пониженным на 15 % содержанием аммиачного азота, добавлением 6-БАП 1,0 мг/л + кинетин 0,5 мг/л при освещении СД-облучателем со спектром 2К:1С:1Б увеличивала КР до 5,1. Укореняемость микрочеренков жимолости синей на питательной среде МС мод. с добавлением ИМК 0,5 мг/л при освещении СД-облучателем 2К:1С:1Б достигала 89,0 %. Условия адаптации микрорастений жимолости синей в субстрате на основе верхового торфа с опрыскиванием 0,01 %-ным раствором НВ-101 обеспечили приживаемость жимолости синей до
93,4 %, при этом выход кондиционных адаптированных микрорастений составил 91,1 %.

На всех этапах микроразмножения in vitro малины оптимальной питательной средой была QL. Добавление в эту среду 6-БАП 1,0 мг/л + ГК 0,5 мг/л при облучении СД-облучателем 2К:1С:1Б обеспечило наибольший коэффициент размножения (5,3), а внесение ИМК 0,5 мг/л + НВ-101 100мкл/л и освещение СД-облучателем 1К:1С:1Б – 100 %-ную укореняемость микрочеренков малины красной. Увеличить КР малины ремонтантной до 4,1 позволило добавление в среду QL 6-БАП 1,0 мг/л + ИМК 0,2 мг/л + ГК 0,5 мг/л и облучение СД 1К:1С:1Б, а внесение ИМК 0,5 мг/л + НВ-101 50мкл/л и облучение СД 2К:1С:1Б повысило укореняемость микрочеренков до 96 %.

Для культивирования in vitro земляники оптимальной питательной средой оказалась МС. При внесении в нее Силипланта и ЭкоФуса по 0,5 мл/л и освещении СД с меняющимся спектром отмечен максимальный в опыте коэффициент размножения микрочеренков земляники садовой (5,9), а использование НВ-101 в концентрации 100 мкл/л при освещении тем же фитооблучателем обеспечило самый высокий КР земляники ремонтантной (7,4). Добавление в среду МС НВ-101 в концентрации 100 мкл/л способствовало 100 %-ному укоренению микрочеренков земляники садовой при освещении СД-облучателем с меняющимся спектром, а земляники ремонтантной – при использовании мигающего СД-облучателя. Адаптация земляники в субстрате на основе верхового торфа с опрыскиванием 0,1 %-ным раствором Силипланта, 0,05 %-ным раствором Силипланта с ЭкоФусом и 0,4 %-ным раствором ПЖВМ при освещении СД-облучателем с меняющимся спектром обеспечила приживаемость 100 % микрорастений.

 

References

1. Kulikov IM, Minakov IA. [Development of gardening in Russia: trends, problems, prospects]. // Agrarnaya nauka Evro-Severo-Vostoka. 2017: 9-15 p.

2. Plaksina TV, Borodulina ID, Vorokhobova LS. Sovremennyi biotekhnologicheskii podkhod k proizvodstvu posadochnogo materiala sadovykh kul'tur. [Modern biotechnological approach to the production of planting material for horticultural crops]. Agrarnaya nauka - sel'skomu khozyaistvu: materialy XII Mezhdunarodnoi nauchno-prakticheskoi konferentsii. Barnaul: Altaiskii gosudarstvennyi agrarnyi universitet. 2017; 239-241 p.

3. Markova MG, Somova EN. [Influence of growth regulators and LED phyto-irradiators on the adaptation of garden strawberries]. Vestnik rossiiskoi sel'skokhozyaistvennoi nauki. 2019. (6): 12-15 p. doihttps://doi.org/10.30850/vrsn/2019/6/12-15.

4. Shipunova AA. Klonal'noe mikrorazmnozhenie plodovykh i dekorativnykh kul'tur v usloviyakh promyshlennogo proizvodstva. [Clonal micropropagation of fruit and ornamental crops in industrial production]. Biotekhnologiya kak instrument sokhraneniya raznoobraziya rastitel'nogo mira (fiziologo-biokhimicheskie, embriologicheskie, geneticheskie i pravovye aspekty): materialy VII Mezhdunar. nauchno-prakt. konf., posvyashch. 30-letiyu otdela biotekhnologii rastenii Nikitskogo botanicheskogo sada. Simferopol': Arial. 2016; 138-139 p.

5. Markova MG, Somova EN, Osokina AS. Pat. 2715695 RF. MPK Sposob ukoreneniya remontantnoi zemlyaniki v kul'ture in vitro. [Method of rooting remontant strawberries in culture in vitro]. Zayavleno 24.05.2019; opubl. 02.03.2020. Byul. № 7. 5 p.

6. Valeev RA, Yuran SI, Kondrat'eva NP. Pat. 127286 RF. MPK. Poleznaya model' “Svetodiodnaya sistema dlya oblucheniya meristemnykh rastenii”. [Utility model “LED system for irradiation of meristemic plants”]. // Zayavleno 17.07.2012; opubl. 27.04.2013 g. 5 p.

7. Mahlein AK, Oerke EC, Dehne HW. [Supplemental blue led lighting array to improve the signal quality in hyperspectral imaging of plants]. Sensors. 2015. 15 (6): 12834-12840 p.

8. Kondrat'eva NP, Il'yasov RI, Bol'shin RG. [The efficiency of the microprocessor system for automatic control of the operation of LED irradiation installations]. Sel'skokhozyaistvennye mashiny i tekhnologii. 2018. 3: 32-37 p.

9. Kolbanova EV. [Influence of phytohormones in the composition of the nutrient medium on the proliferation of regenerated plants of blue honeysuckle varieties (Lonicera caerulea L. var. Kamtschatica)]. Vestsі natsyyanal'nai akademіі navuk Belarusі. Seryya biyalagichnykh navuk. Mіnsk. 2020. 65 (1): 88-97 p. Doihttps://doi.org/10.29235/1029-8940-2020-56-1-88-97.

10. Subin A, Tkalenko G, Boroday V. Adaptation of regenerated strawberry plants to ex vitro using biological preparations. Agrobіologіya. 2016. 2 (128): 85-90 p.

11. Markova MG, Somova EN. [Use of waste products of larvae of the large wax moth in clonal micropropagation of garden strawberry]. Vestnik rossiiskoi sel'skokhozyaistvennoi nauki. 2020. (4): 66-68 p. doihttps://doi.org/10.30850/vrsn/2020/4/66-68.

Login or Create
* Forgot password?