Введение Восприятие    мировым    научным    сообществом    молочной    сыворотки    как    загрязняющего    вещества    изменилось    с    открытием    ее    функциональных    и    биологически    активных    свойств    [1].    Молочные    белки    играют    важную    роль    не    только    в    качестве    источника    незаменимых    аминокислот    и    азота,    но    и    как    богатый    источник    различных    биологически    активных    пептидов    [2].    Биоактивные    пептиды,    находясь    в    структуре    белка,    не    проявляют    своих    функциональных    свойств.    Их    высвобождение,    а    следовательно,    и    усиление    биофункциональных    свойств    может    происходить    за    счет    расщепления    структуры    белка    в    результате    гидролиза    пищеварительными    ферментами,    протеолитическими    микроорганизмами    и    действием    растительных    или    микробных    протеаз    [3,    4].    Специфичность    протеаз    влияет    на    длину    пептида,    а    также    на    состав,    структурные    свойства    и    последовательности    аминокислот.    Это    влияет    на    биологическую    активность    гидролизатов    [5,    6].    Обработка    белкового    субстрата    различными    протеазами    с    различными    спектрами    специфичности    приводит    к    образованию    гидролизатов,    которые    содержат    смесь    свободных    аминокислот,    олигопептидов    с    высокой    и    средней    молекулярной    массой    и    коротких    пептидов    с    разными    аминокислотными    последовательностями.    Биологическая    активность    гидролизатов    обусловлена    синергетическим    действием    различных    биоактивных    пептидов    [5].    За    последние    два    десятилетия    были    проведены    многочисленные    исследования    антиоксидантных,    АПФ-ингибирующих,    антигипертензивных,    имму- ностимулирующих,    антимикробных    и    других    
биологических    свойств    пептидов,    полученных    в    результате    гидролиза    казеиновых    и    сывороточных    белков.    Эти    исследования    подтверждают    актуаль- ность    использования    молочных    белков    в    качестве    источника    биологически    активных    пептидов    [2,    3].    
 Специфичность    ферментов,    используемых    для    протеолиза    молочного    белка,    является    важным    фактором    в    получении    биофункциональных    белковых    гидролизатов    с    желаемой    биологической    активностью    [5,    7].    В    данной    работе    представлена    оценка    специфичности    различных    ферментных    препаратов,    используемых    для    получения    гидролизатов    белков    молочной    сыворотки    с    противодиабетической    активностью.    Диабет    является    одним    из    самых    распространен- ных    хронических    заболеваний.    По    оценкам    Междуна- родной    федерации    диабета,    в    настоящее    время    во    всем    мире    страдают    от    диабета    415    миллионов    человек,    91    %    из    которых    имеют    сахарный    диабет    2    типа    (СД-2)    [8,    9].    СД-2    является    метаболическим    сбоем    в    организме,    характеризующимся    нарушением    секреции    инсулина    β-клетками    и    резистентностью    к    инсулину    в    тканях.    Такое    состояние    нередко    связано    с    развитием    ряда    осложнений,    включая    гипертонию    и    сердечно-сосудистые    заболевания    [10].    
Объекты и методы исследования В    качестве    объектов    исследований    были    определены    сывороточные    белки,    белки    молока,    различные    коммерческие    ферментные    препараты,    а    также    процесс    гидролиза    белков,    направленный    на    получение    пептидов    с    противодиабетической    активностью.    Для    написания    обзора    было  проанализировано    34    зарубежных    и    литературных    источника,    отражающих    суть    изложенной    проблемы.
Результаты и их обсуждение Множество    работ    посвящено    изучению    ингибирования    дипептидилпептидазы    IV    (DPP-IV),    
 метаболического    фермента,    различными    пепти- дами,    полученными    из    пищевых    белков.    Во    время    постпрандиальной    фазы    DPP-IV    способен    расщеплять    инкретины    –    гормоны    желудочнокишечного    тракта,    которые    вырабатываются    в    ответ    на    прием    пищи    и    вызывают    стимуляцию    выработки    инсулина.    К    инкретинам    относятся    два    гормона:    глюкагоноподобный    пептид-1    (ГПП-1)    и    глюкозозависимый    инсулинотропный    поли- пептид    (ГИП).    Расщепление    инкретина    приводит    к    их    инактивации,    которая    вызывает    потерю    их    инсулинотропной    активности    [11].    Ингибиторы    DPP-IV    и    α-глюкозидазы,    которые    относятся    к    классу    глиптинов,    представляют    собой    два    класса    фармакотерапевтических    агентов,    используемых    для    лечения    диабета    2    типа    в    качестве    средства    регулирования    уровня    глюкозы    в    сыворотке    крови    после    приема    пищи.    Однако    при    использовании    глиптинов    для    лечения    диабета    2    типа    проявляются    побочные    эффекты    [12].    В    данном    контексте    особый    интерес    может    представлять    поиск    природных    соединений,    которые    не    связаны    с    какими-либо    неблагоприятными    побочными    эф- фектами.    Эффективность    большинства    пептидов,    ингибирующих    DPP-IV    и    полученных    из    пищевых    белков,    идентифицированных    в    литературе,    в    1000    раз    
 меньше,    чем    у    глиптинов    [13].    В    настоящее    время    наиболее    мощным    пептидом,    ингибирующим    DPP-IV,    идентифицированным    в    пищевых    белках,    является    Ile-Pro-Ile    (дипротин    A)    со    значением    IC50 4,7    μM,    который    присутствует    в    пищевых    белках,    таких    как    κ-казеин    или    овотрансферрин    из    куриного    яйца    [12].    Разнообразные    белки    рассматриваются    как    предшественники    пептидов,    ингибирующих    
 DPP-IV    [14].    В    различных    исследованиях    подходы    in silico    выявили    несколько    пептидов,    зашифрованных    в    аминокислотных    последовательностях    пищевых    белков,    которые    могут    действовать    как    ингибиторы    DPP-IV,    включая    белки    молочной    сыворотки    крупного    рогатого    скота    [12,    13,    15,    16].    В    работе    A.    B.    Nongonierma    с    соавторами    была    исследована    ингибирующая    DPP-IV    активность    гидролизата    сывороточного    белка,    полученного    с    использованием    пищевого    фермента    Королаза    PP    при    соотношении    фермента    к    субстрату    (E:S)    1    %    (вес/вес)    при    50    °C    в    течение    240    мин.    Гидролиз    проводили    при    постоянном    pH    7,0.    Значение    ингиби- рующей    концентрации    полученного    гидролизата    IC50    составляло    1,34    ±    0,11    мг/мл.    Имитация    переваривания    гидролизата    сывороточного    белка    
в    желудочно-кишечном    тракте    увеличивала    его    ингибирующий    потенциал    DPP-IV    (IC50    =    1,02    мг/мл).    
 Фракционирование    гидролизата    сывороточных    белков    через    мембрану    с    размером    пор    5    кДа    с    последующим    фракционированием    полученного    пермеата    с    использованием    мембраны    2    кДа    привело    к    обогащению    конечного    пермеата    пептидами,    ингибирующими    DPP-IV.    Значение    IC50    пермеата    
 5    кДа    (0,95    ±    0,16    мг/мл)    было    значительно    выше    по    сравнению    с    пермеатом    2    кДа    (0,48    ±    0,11    мг/мл).    
 Пермеаты,    генерируемые    через    УФ    мембраны    с    размером    пор    5    и    2    кДа,    обладали    более    сильным    ингибирующим    DPP-IV    эффектом,    чем    концентраты.    Однако    они    были    примерно    в    500    раз    менее    эффективны,    чем    лекарственный    препарат    дипротин    А    (IC50    =    0,001454    ±    0,000218    мг/мл)    [16].        В    последующих    исследованиях    A.    B.    Nongonierma    с    соавторами    был    изучен    потенциал    изолята    молочных    белков    (ИМБ),    гидролизованного    Нейтразой    0.8    LTM,    в    качестве    источника    пептидов,    ингибирующих    DPP-IV    [12].    Было    показано,    что    изменение    параметров    гидролиза    (времени    и    температуры)    может    влиять    на    ингибирующую    активность    DPP-IV    у    получающихся    гидролизатов    ИМБ.    Стабильность    ингибирующих    DPP-IV    свойств    гидролизатов    ИМБ    после    инкубации    с    пищеварительными    ферментами    авторы    оценивали    с    использованием    протокола    искусственного    желудочно-кишечного    пищеварения    (SGID)    in vitro с    применением    пепсина.    В    отобранных    гидролизатах    ИМБ    авторами    были    идентифицирован    пептид    LKPTPEGDLEIL    f    (46–57),    
 полученный    из    β-лактоглобулина    (табл.    1)    и    ингибирующий    DPP-IV    со    значением    IC50    74    μM.    Пептид    в    ходе    SGID    распадался    на    более    короткие    фрагменты,    такие    как    LKPTPEGDL    f    (46–54)    и    LKPTPEGDLE    f    (46–55),    которые    также    проявляли    высокие    ингибирующие    свойства    к    DPP-IV    (значения    IC50    для    DPP-IV    45    и    42    μM    соответственно)    
 (табл.    1)    [12].    Данные    последовательности    пептидов    были    обнаружены    ранее    в    работе    I.    M.    E.    Lacroix    и    E.    C.    Y.    Li-Chan,    где    также    сообщается    об    их    ингибирующих    DPP-IV    свойствах    [17].    Помимо    пептидных    последовательностей,    описанных    выше,    другими    авторами    после    исследования    гидролизатов    β-лактоглобулина    на    аналогичных    моделях    желудочно-кишечного    тракта    было    идентифицировано    2    последовательности    пептидов,    ингибирующих    DPP-IV:    TPEVDDEALEK    f    (125–135)    
 (IC50    =    320    μM)    и    VLVLDTDYK    f    (92–100)    
 (IC50    =    424    μM).    Ими    же    обнаружены    противодиабетические    пептиды    из    гидролизатов    лактоферрина:    WK    f    (268–269)    (IC50    =    41    μM)    и    WQ    f    (22–23)    (IC50    =    120    μM)    [11].    В    своих    исследованиях    O.    Power    с    соавторами    использовал    коммерческий    β-лактоглобулин    в    качестве    субстрата    для    приготовления    гидролизата    с    использованием    фермента    трипсина.    Полученный    
309
Агаркова Е. Ю. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 2 С. 306–318
гидролизат    ингибировал    DPP-IV    со    значением    IC50    1,6    мг/мл,    демонстрируя    антиоксидантную    и    ингибирующую    АПФ    активность    [18].    Гидролизат    фракционировали    через    мембраны    с    размером    пор    1,    2    и    5    кДа.    Диафильтрационные    пермеаты,    последовательно    пропущенные    через    мембраны    с    размером    пор    5    и    2    кДа,    показали    повышенное    ингибирование    DPP-IV    со    значениями    IC50    0,58    и    0,53    мг/мл    соответственно.    Концентраты    после    диафильтрации    не    оказывали    существенного    влияния    на    DPP-IV.    Это    подтверждает    теорию,    согласно    которой    за    наблюдаемую    биологическую    активность    ответственны    пептиды    с    более    низкой    молекулярной    массой.    Из    этого    гидролизата    авторы    также    идентифицировали    пептид    VAGTWY    f    (15–20)    –    наиболее    сильный    ингибитор    DPP-IV    
 (IC50    =    74,9    μМ).    Также    авторами    была    продемонстрирована    ингибирующая    активность    DPP-IV    фрагментов    IPAVFK    и    TPEVDDEALEK    
 (табл.    1)    [18].    VAGTWY    является    многофункциона- льным    биоактивным    пептидом,    поскольку    он    также    проявлял    значительную    антиоксидантную    и    АПФингибирующую    активность    [18,    19].    Кроме    того,    VAGTWY,    IPAVFK    и    TPEVDDEALEK    обладают    антимикробными    свойствами    в    отношении    грамположительных    бактерий    [19].    В    работе    M.    Uchida    с    соавторами    сообщалось,    что    гидролизат    β-лактоглобулина,    полученный    
с    использованием    фермента    трипсина,    снижал    уровень    глюкозы    в    крови    у    мышей,    по    сравнению    с    контрольной    группой,    после    перорального    теста    на    толерантность    к    глюкозе.    Полученный    гидролизат    β-лактоглобулина    обладал    способностью    ингибировать    DPP-IV    на    уровне    IC50    =    210    μМ.    Авторы    связывают    такой    уровень    ингибирующей    способности    DPP-IV    с    присутствием    в    составе    гидролизата    пептида    VAGTWY    f    (15–20),    обладающего    ингибирующей    способностью    на    уровне    IC50    =    174    μМ    [20].    В    работе    E.    Mares-Mares    с    соавторами    для    поиска    новых    ингибиторов    DPP-IV    была    получена    первичная    и    вторичная    сыворотка    свежих    (незрелых)    сыров    и    сыров    Оахака,    которые    традиционно    потребляются    в    Мексике.    Процесс    получения    вторичной    сыворотки    каждого    продукта    был    основан    на    том,    что    каждую    сыворотку    подкисляли    0,5    %    молочной    кислотой    и    подвергали    термической    обработке    при    95    °С    в    течение    30    мин.    Для    получения    гидролизатов    были    использованы    ферменты:    пепсин    (ЕС    3.4.23.1)    из    желудка    свиньи,    трипсин    (ЕС    3.4.21)    и    химотрипсин    (ЕС    3.4.21.1)    из    поджелудочной    железы    крупного    рогатого    скота.    При    проведении    гидролиза    пепсином    из    выделенных    сывороточных    белков    готовили    водные    растворы    с    концентрацией    100    мг    белка/мл,    
 рН    раствора    доводили    до    2,0    с    помощью    1    М    HCl.    
Таблица    1.    Пептиды,    полученные    из    сывороточных    белков    и    обладающие    ингибирующей    активностью     в    отношении    дипептидилпептидазы    IV    (DPP-IV) Table    1.    Peptides    derived    from    whey    proteins    цшер    inhibitory    activity    against    dipeptidyl    peptidase    IV    (DPP-IV) Исходный    белок Фермент Аминокислотная    последовательность IC50,    μM Ссылка
β-лактоглобулин
Нейтраза    0,8    LTM LKPTPEGDLEIL    f    (46–57) 74,0 [11]Нейтраза    0,8    LTM,    затем    пепсин LKPTPEGDL    f    (46–54) 45,0 LKPTPEGDLE    f    (46–55) 42,0 In silico IPA    f    (78–80) 49,0 [21]
Трипсин
VAGTWY    f    (15–20) 74,9 [22] IPAVF    f    (78–82) 44,7 [18] IPAVFK    f    (78–83) 149,1 [16] TPEVDDEALEK    f    (125–135) 578,7 [16] VLVLDTDYK    f    (92–100) 424,4 [18]
Пепсин
LKPTPEGDL    f    (46–54) 45,0 [20] LKPTPEGDLEIL    f    (46–57) 57,0 [20]
α-лактальбумин
Пепсин
IPAVFKIDA    f    (78–86) 191,0
[20]
WLAHKAL    f    (104–110) 286,0 WLAHKALCSEKLDQ    f    (104–117) 141,0 LAHKALCSEKL    f    (105–115) 165,0 LCSEKLDQ    f    (110–117) 186,0 TKCEVFRE    f    (4–11) 166,0 IVQNNDSTEYGLF    f    (41–53) 337,0
Трипсин
EQLTKCEVFR    f    (1–10) 883,0
[8]
KILDKVGINYWLAHK    f    (94–108) 930,0 ILDKVGINYWLAHK    f    (95–108) 456,0 VGINYWLAHK    f    (99–108) 765,0 LDQWLCEKL    f    (115–123) 131,0
310
Agarkova E.Yu. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 2, pp. 306–318 В    случае    протеолиза    трипсином    и    химотрипсином    концентрация    белкового    раствора    составляла    50    мг    белка/мл,    величина    активной    кислотности    дотитровывалась    до    7,8    и    8,0    с    помощью    1    М    NaOH.    Ферментативные    реакции    проводили    при    37    °С    в    течение    24    ч.    Полученные    гидролизаты    фракционировали    через    гидрофильную    мембра- ну    с    размером    пор    10    кДа.    Исследование    противодиабетической    активности    продуктов    гидролиза    показало,    что    наибольшее    количество    пептидов,    ингибирующих    DPP-IV,    обнаружено    в    гидролизатах    первичных    сывороток    из-под    сыров    Оахака,    полученных    при    помощи    пепсина    и    трипсина.    Максимальная    ингибирующая    способность    составила    92,86    мкг/мл    [21]. В    исследованиях,    проводимых    в    испанском    научно-исследовательском    институте    пищевой    промышленности,    показано,    что    гидролизат    концентрата    сывороточного    белка,    полученного    с    применением    фермента    трипсина,    ингибирует    активность    DPP-IV    со    значением    IC50    =    1,51    мг/мл.     Авторами    из    полученного    гидролизата    было    идентифицировано    шестнадцать    пептидов    из    β-лактоглобулина.    Из    них    пептиды    IPAVF    и    IPAVFK    показали    наиболее    высокое    ингибирование    DPPIV    [22].    Кроме    того,    было    доказано,    что    пептид    VLVLDTDYK    из    β-лактоглобулина    (IC50    =    424,4    μM)    также    обладает    противомикробным    действием    [22].    В    научных    работах    I.    M.    E.    Lacroix    и    E.    C.    Y.    LiChan    была    описана    оценка    ингибирующей    активности    DPP-IV    молочных    белков,    полученных    при    гидролизе    казеината    натрия,    изолята    сывороточных    белков    (ИСБ),    концентрата    молочного    белка    и    сухого    обезжиренного    молока    с    использованием    12    ком- мерческих    протеаз    [23].    Полученные    гидролизаты    были    подвергнуты    перевариванию    в    имитационном    желудочно-кишечном    тракте    с    использованием    системы    пепсин-панкреатин.    Гидролизат    ИСБ,    полученный    после    60    мин    обработки    пепсином,    показал    более    высокое    ингибирование    DPP-IV    
 (IC50    =    0,075    мг/мл).    Дальнейший    гидролиз    панкреатином    уменьшал    ингибирующий    потенциал    DPP-IV.    Помимо    пепсина,    проводились    исследования    и    других    коммерческих    протеаз    на    предмет    получения    противодиабетических    пептидов    из    изолята    сывороточных    белков.    Процесс    проводили    также    в    течение    60    мин.    Гидролизаты,    полученные    при    помощи    ферментных    препаратов    термолизина    и    Umamizyme    К,    проявили    достаточно    высокую    способность    ингибировать    DPP-IV    (63    и    61    %    при    0,475    мг/мл).    Однако    гидролизаты,    полученные    при    помощи    пепсина,    имели    более    сильную    ингибирующую    активность    –    78    %    ингибирования    DPP-IV    при    0,375    мг/мл    [23].    Те    же    специалисты    в    другой    работе    гидролизовали    пепсином    в    течение    60    мин    изолят    сывороточного    белка    с    получением    гидролизатов    α-лактальбумина,    β-лактоглобулина,    сывороточного    альбумина    и    лактоферрина    [24].    Полученные    гидролизаты    были    изучены    на    предмет    их    способности    служить    естественными    источниками    ингибиторов    DPP-IV    и    α-глюкозидазы.    Хотя    ингибирование    активности    DPP-IV    наблюдалось    во    всех    гидролизованных    пепсином    сывороточных    белках,    гидролизат    α-лактальбумина    показал    наибольшую    эффективность    со    значением    IC50    =    0,036    мг/мл.    И    наоборот,    только    изолят    сывороточного    белка,    гидролизаты    β-лактоглобулина    и    α-лактальбумина    проявляли    некоторую    ингибирующую    активность    в    отношении    α-глюкозидазы    (рис.    1).    На    рисунке    1    представлена    степень    ингибиро- вания    DPP-IV    различных    гидролизатов    молочных    белков.    Каждый    столбец    представляет    среднее    значение    и    стандартное    отклонение    трех    опреде- лений.    Данные,    представленные    на    рисунке    1,    коррелируют    с    данными,    представленными    выше,    и    наглядно    демонстрируют    высокую    ингибирующую    способность    сывороточных    белков,    особенно    α-лактальбумина.    Гидролиз    проводили    при    помощи    пепсина,    фермент-субстратное    соотношение    составило    4,0    %,    температура    инкубирования    –    37    °С,    
 продолжительность    процесса    при    постоянном    перемешивании    –    60    мин.    Это    исследование    показывает,    что    пептиды,    вырабатываемые    из    сывороточных    белков,    могут    использоваться    в    качестве    функциональных    пищевых    ингредиентов    в    специализированных    продуктах    продиводиабетической    терапии    [17].    В    следующей    работе    I.    M.    E.    Lacroix    и    E.    C.    Y.    Li-Chan    последовательно    фракционировали    гидролизованный    пепсином    изолят    сывороточного    белка    и    α-лактальбумин,    проявляющие    ингибирующую    активность    DPP-IV.    Затем    анализировали    пептидный    Рисунок    1.    Степень    ингибирования    DPP-IV    различных    видов    гидролизатов:    1    –    гидролизат    α-лактальбумина;    2    –    гидролизат    β-лактоглобулина;    3    –    гидролизат    лактоферрина;    4    –    гидролизат    бычьего     сывороточного    альбумина Figure    1.    Шnhibition    of    DPP-IV    in    various    types    of    hydrolysates:     1    –    α-lactalbumin    hydrolyzate;    2    –    β-lactoglobulin    hydrolyzate;     3    –    lactoferrin    hydrolyzate;    4    –    bovine    whey    albumin    hydrolysate 100 80 60 40 20 0 Степень    ингибирования    DPP-IV,    %
311
Агаркова Е. Ю. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 2 С. 306–318 состав    полученных    активных    фракций.    В    результате    установлено,    что    две    фракции    из    полученных    имели    наиболее    высокую    ингибирующую    активность    DPP-IV    со    значениями    IC50    0,216    и    0,081    мг/мл    
 соответственно    по    сравнению    с    полным    (нефракционированным)    гидролизатом    изолята    сывороточного    белка    (IC50    =    0,075    мг/мл)    [24].    Эти    эксперименты    также    продемонстрировали    высокое    ингибирование    DPP-IV    фракциями    гидролизата,    содержащего    большое    количество    неполярных    пептидов.    Среди    идентифицированных    последовательностей    было    определено    24    пептида,    полученных    из    α-лактальбумина,    и    11    из    β-лактоглобулина    и    проанализировано    их    влияние    на    активность    DPP-IV.    Среди    синтезированных    пептидов    LKPTPEGDL    и    LKPTPEGDLEIL    из    β-лактоглобулина    (IC50    =    45    и    57    μМ    соответственно)    и    WLAHKALCSEKLDQ    из    α-лактальбумина    
 (IC50    =    141    μМ)    показали    более    высокий    ингиби- рующий    потенциал    к    DPP-IV    (табл.    1)    [20].    Однако    эти    пептиды    были    примерно    в    10    раз    менее    эффективны,    чем    эталонный    ингибитор    дипротин    А    (IC50    =    4,7    μМ)    [24].        В    работе    S.    Maux    с    соавторами    гидролизаты    β-лактоглобулина    были    получены    с    использованием    фермента    эластаза    при    фермент-субстратном    отношении    (E:S)    0,5,    1,0    и    1,5    %    до    достижения    требуемых    значений    степени    гидролиза    9    и    13    %    [25].    
 Авторы    сравнивали    значения    ингибирования    DPP-IV    
 в    гидролизатах    β-лактоглобулина    в    условиях    снижения    фермент-субстратного    отношения    при    достижении    одинакового    уровня    степени    гидролиза    путем    увеличения    времени    гидролиза.    Образцы    с    одинаковой    степенью    гидролиза,    полученные    с    различными    фермент-субстратными    отношениями,    показали    сравнимые    профили    молекулярномассового    распределения    и    ингибирующую    DPP-IV    активность    (P    >    0,05).    Анализ    методом    тандемной    масс-спектрометрии    с    жидкостной    хрома- тографией    (ВЭЖХ    МС/МС)    показал,    что    62    и    84    %    
 идентифицированных    пептидов    были    общими    в    гидролизатах,    имеющих    степень    гидролиза    9    или    13    %    
 соответственно    (рис.    2).    Были    отмечены    различия    в    пептидах,    идентифицированных    в    гидролизатах,    имеющих    сходные    степени    гидролиза.    Эти    различия    могут    быть    связаны    с    изменениями    кинетики,    селективности    и    активности    фермента,    которые    могут    зависеть    от    используемой    концентрации    
 фермента    [25].    Количество    идентифицированных    пептидов,    являющихся    общими    или    специфичными    для    каждого    образца,    было    представлено    с    использованием    диаграмм    Венна    для    каждого    значения    степени    гидролиза    (DH)    (рис.    2).    Образцы    со    степенью    гидролиза    9    %    (DH9)    имели    109    идентичных    пептидов,    тогда    как    образцы    со    степенью    гидролиза    13    %    (DH13)    имели    105    одинаковых    пептидов.    Образцы,    полученные    с    использованием    одного    и    того    же    фермент-субстратного    отношения,    но    разных    значений    степени    гидролиза,    имели    несколько    общих    пептидных    последовательностей.    Например,    104,    120    и    106    общих    пептидов    присутствовали    в    образцах    со    значениями    E:S    0,5,    1,0    и    1,5    %    соответственно.    Это    исследование    показало,    что    снижение    ферментсубстратного    отношения    может    быть    использовано    для    снижения    стоимости    производства    гидролизата    без    отрицательного    влияния    на    изучаемую    биологическую    активность    и    физико-химические    свойства    [25]. В    одной    из    работ    C.    Jia    с    соавторами    описано,    что    концентрат    сывороточного    белка,    дополнительно    обогащенный    α-лактальбумином,    был    подвегнут    гидролизу    белка    трипсином.    Затем    образцы    полученных    гидролизатов    фракционировались    в    
    (А)    (В)
Рисунок    2.    Диаграмма    идентифицированных    пептидов,    которые    были    общими    или    специфичными    для    гидролизованного    β-лактоглобулина    до    степени    гидролиза    (DH)    9    %    (A),    13    %    (B)    при    фермент-субстратном    отношении    (E:S)    0,5    %    (синий),    1,0    %    (желтый),    1,5%    (вес/вес)    сиреневый Figure    2.    Identified    peptides,    common    or    specific    for    hydrolyzed    β-lactoglobulin    to    a    degree    of    hydrolysis    (DH)    of    9%    (A),    13%    (B)    with     an    enzyme-substrate    ratio    (E:S)    of    0.5%    (blue),    1.0%    (yellow),    1.5%    (weight/weight,    violet)
312
Agarkova E.Yu. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 2, pp. 306–318 полупрепаративном    масштабе    с    использованием    гельфильтрационной    хроматографии    [8].    Ингибирующие    DPP-IV    пептиды    из    гидролизатов    отделяли    ультрафильтрацией    с    мембранными    пакетами    с    отсечками    молекулярной    массы    10    кДа,    5    кДа    и    3    кДа.    Пептиды    анализировали    с    использованием    ВЭЖХ    в    сочетании    с    тандемной    масс-спектрометрией    
 (RP-HPLC-MS/MS).    Их    ингибирующую    активность    в    отношении    DPP-IV    определяли    ферментативным    анализом.    Из    всех    идентифицированных    пептидов    6    были    получены    из    α-лактальбумина.    За    исключением    пептидного    фрагмента    LDQWLCEK    f    (115–122),    который    не    обладал    ингибирующей    активностью,    все    идентифицированные    пептиды    EQLTKCEVFR    f    (1–10),    KILDKVGINYWLAHK    f    (94–108),    ILDKVGINYWLAHK    f    (95–108),    VGINYWLAHK    f    (99–108)    и    LDQWLCEKL    f    (115–123)    имели    ингибирующую    DPP-IV    активность    со    значением    IC50    883    ±    36,8    μМ,    930    ±    35,7    μМ,    456    ±    43,5    μМ,    765    ±    23,9    μМ    и    131    ±    33,9    μМ    соответственно    (табл.    1).    Наибольшую    ингибирующую    активность    проявлял    LDQWLCEKL    f    (115–123)    с    IC50 
 131    ±    33,9    μМ.    Кроме    того,    LDQWLCEKL    проявлял    типичный    неконкурентный    способ    ингибирования.    Результаты    работы    авторов    показывают,    что    α-лактальбумин    содержит    активные    пептиды    с    ингибирующей    активностью    DPP-IV,    которые    можно    использовать    для    профилактики    и    лечения    СД-2    [8]. Дипротин    A    (IPI)    и    дипротин    B    (VPL)    являются    мощными    ингибиторами    DPP-IV,    проявляющими    явное    конкурентное    поведение,    действуя    в    качестве    ферментных    субстратов.    В    работе    G.    Tulipano    с    соавторами,    используя    in vitro    оценки    для    выявления    противодиабетических    пептидов,    было    показано,    что    пептид    IPA,    полученный    из    β-лактоглобулина    путем    расщепления    in silico на    базе    BioPep    и    впоследствии    синтезированный,    является    конкурентным    инги- битором    DPP-IV    со    значением    IC50    =    49    μМ    [26].    Конкурентное    ингибирование    DPP-IV    выявлено    для    пептида    IPAVFKIDA    (из    β-лактоглобулина),    что    может    быть    следствием    его    субстратоподобной    структуры    [24]. В    одной    из    исследовательских    работ    
 A.    B.    Nongonierma    с    соавторами    для    изучения    пептидных    аналогов    Дипротина    A    (Ile-Pro-Ile)    был    использован    метод    in silico.    Было    исследовано    
 25    пептидных    последовательностей,    наиболее    часто    встречающихся    в    молочных    белках.    Значения    IC50 в    отношении    ингибирования    DPP-IV    варьировались    от    3,9    ±    1,0    μМ    (Ile-Pro-Ile)    до    247,0    ±    32,7    μМ    (PhePro-Phe).    Большинство    исследованных    пептидов    сохраняли    пептидную    структуру    в    течение    30    мин    протеолиза.    Несмотря    на    то    что    были    выявлены    пептиды,    ингибирующие    DPP-IV,    их    активность    не    была    столь    сильной,    как    активность    Дипротина    A.    
 Авторы    работы    отмечают,    что    наличие    Pro    в    центре    трипептидной    цепи    является    необходимым    условием    для    достижения    максимально    высокого    ингибирования    DPP-IV.    Молекулярная    стыковка    показала    похожие    взаимодействия    между    Ile-Pro-Ile    и    его    ассоциированными    пептидными    аналогами.    Этот    результат    вместе    с    высокой    стабильностью    дипротина    A    и    его    связанных    пептидных    аналогов    с    гидролитическим    действием    DPP-IV    позволяет    предположить,    что    в    ингибирование    DPP-IV    этими    пептидами    вовлечены    сложные    механизмы.    Пептиды,    описанные    в    этом    исследовании,    могут    найти    потенциальное    применение    для    управле- ния    гликемией    и    энергетического    гомеостаза    
 у    людей    [27]. Как    правило,    гидролизат    белков    содержит    смесь    биологически    активных    и    неактивных    пептидов    в    дополнение    к    негидролизованному    белку.    Мембранная    обработка    может    быть    решением    данной    проблемы,    поскольку    короткие    пептиды    с    требуемой    биологической    активностью    могут    быть    получены    в    пермеате    ультрафильтрационной    установки,    в    то    время    как    пептиды    с    высокой    молекулярной    массой    останутся    в    концентрате.    Мембранная    фильтрация    поможет    избежать    чрезмерного    гидролиза,    т.    к.    он    приводит    к    высокому    содержанию    свободных    аминокислот,    которые    негативно    влияют    на    сенсорные    свойства    конечного    продукта    и    обеспечивают    высокую    осмоляльность.    Следовательно,    гидролитическая    реакция    должна    строго    контролироваться    [28]. Мембранные    биореакторы    –    одна    из    наиболее    перспективных    и    динамически    развивающихся    областей    промышленной    технологии.    Данная    технология    представляет    собой    комбинирование    различных    биохимических    (под    действием    катализатора    биологического    происхождения,    т.    е.    фермента)    и    мембранных    процессов    разделения.    Ферментативные    мембранные    реакторы    работают,    удерживая    фермент    и    питающий    субстрат    на    стороне    ретентата,    в    то    же    время    позволяя    вновь    образованным    биопептидам    проникать    через    мембрану,    создавая    поток    продукта    с    повышенной    биологической    активностью    [29,    30]. Непрерывная    обработка    в    производстве    пептидов    представляет    собой    область    повышенного    интереса.    В    исследовании    J.    O’Halloran    с    соавторами    был    разработан    ферментативный    мембранный    реактор,    в    котором    изолят    сывороточного    белка    подвергали    ферментативному    гидролизу    для    получения    ингибирующих    DPP-IV    пептидов    [31].    
 Авторами    были    испытаны    два    отдельных    фермента    Королаза    2TS    и    Протамекс    в    обычных    периодических    процессах    ультрафильтрации    и    ферментативном    мембранном    реакторе    непрерывного    действия    (рис.    3).    Каждый    фермент    вводили    в    реакционный    сосуд    и    удерживали    на    стороне    ретентата,    оставляя    его    свободным    и    не    связанным    с    мембраной.    Авторами    было    отмечено,    что    
313
Агаркова Е. Ю. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 2 С. 306–318
производительность    ферментативного    мембранного    реактора    непрерывного    действия,    по    сравнению    со    стандартным    способом    периодической    обработки,    возросла    на    7,2    %    и    8,7    %    при    использовании    Протамекса    и    Королазы    соответственно    [31].    При    этом    пермеат,    полученный    с    использованием    Протамекса,    показал    на    33,7    %    выше    значение    ингибирующей    DPP-IV    активности    по    сравнению    с    пермеатом,    полученным    с    использованием    Королазы    2TS.    Из    данных    рисунка    видно,    что    существует    четко    прослеживаемая    взаимосвязь    между    степенью    гидролиза    и    степенью    ингибирования    DPP-IV.    Положительную    корреляцию    между    степенью    гидролиза    и    степенью    ингибирования    DPP-IV    можно    проследить    до    достижения    120    мин    
 эксперимента,    после    чего    биологическая    активность    выравнивается,    оставаясь    на    данном    этапе    на    уровне    37    %    как    в    случае    использования    Протамекса,    так    и    Королазы    2TS.    Наиболее    сильные    различия    в    степени    ингибирования    отмечены    на    ранних    стадиях    гидролиза    –    по    истечении    6    и    12    мин.    При    этом    гидролизаты,    полученные    с    помощью    Протамекса,    через    6    мин    проявили    способность    ингибировать    DPP-IV    более    чем    в    два    раза,    чем    гидролизаты,    полученные    с    помощью    Королазы    2TS.    Это    подчеркивает    тот    факт,    что    степень    гидролиза    не    обязательно    является    основным    маркером    биологической    активности.    В    первую    очередь    тип    и    специфичность    фермента    могут    оказывать    большее    влияние    на    активность    гидролизата.    В    данной    работе    авторы    доказали    возможность    использования    разработанного    ими    мембранного    реактора    для    получения    противодиабетических    пептидов    при    вышеописанных    условиях    [31]. В    работе    A.    B.    Nongonierma    с    соавторами    для    оптимизации    условий    ферментативного    гидролиза    изолята    молочного    белка    ферментом    трипсин    для    высвобождения    пептидов,    ингибирующих    DPP-IV,    
 был    проведен    полнофакторный    эксперимент    с    тремя    вариабельными    параметрами,    включая    температуру    
(40,    50    и    60    °C),    отношение    фермента    к    субстрату    (E:S    0,50,    1,25    и    2,00    %    (вес/вес))    и    время    гидролиза    (60,    150    и    240    мин).    Полученные    результаты    многофакторных    экспериментов    были    подвергнуты    статистической    обработке    с    использованием    блока    DOE.    Всего    в    исследовании    было    использовано    
 15    гидролизатов    (H1–H15).    Степень    гидролиза    (СГ)    варьировалась    от    6,98    ±    0,31    %    (H8)    до    
 12,75    ±    0,62    %    (H10).    Полумаксимальная    ингиби- рующая    концентрация    DPP-IV    (IC50)    варьировалась    от    0,68    ±    0,06    мг/мл    (H11)    /    0,68    ±    0,10    мг/мл    (H4)    до    1,59    ±    0,11    мг/мл    (H8).    Температура    не    влияла    (P >    0,05)    на    значение    IC50    DPP-IV.    Однако    увеличение    E:S    или    времени    значительно    снижало    IC50    DPP-IV    (P    <    0,05).    Значение    IC50    для    DPP-IV,    
 равное    0,69    мг/мл    и    рассчитанное    с    помощью    методологии    поверхности    отклика    для    гидролизата,    полученного    при    50,5    °C,    2    %    ES    и    231    мин    (H16),    было    аналогично    экспериментально    полученному    значению    (DPP-IV    IC50    =    0,66    ±    0,10    м/мл,    
 Р    >    0,05,    n    =    3).    После    исследования    на    имитационной    модели    желудочно-кишечного    тракта    образца    H16    значение    IC50    DPP-IV    увеличилось    (Р    <    0,05)    до    
 0,90    ±    0,07    мг/мл.    Потенциально    известные    пептидные    последовательности,    ингибирующие    DPP-IV,    были    идентифицированы    в    H16    с    помощью    жидкостной    хроматографии    и    тандемной    масс-спектрометрии    (LC-MS/MS),    источниками    которых    был    как    казеин,    так    и    их    сывороточные    белки.    Некоторые    пептиды    также    присутствовали    в    образце    H16,    подвергнутого    искусственному    перевариванию.    Это    говорит    о    том,    что    они    были    устойчивы    к    желудочно-кишечным    ферментам.    Гидролизаты    изолятов    молочного    белка    могут    представлять    интерес    для    регуляции    уровня    глюкозы    в    сыворотке    крови    у    людей    [32].
Выводы Учитывая    разнообразие    пептидов    и    способы    их    действия,    гидролизаты    сывороточного    белка    или    смеси    в    них    пептидов    могут    действовать    синергетически,    приводя    к    большему    ингибированию    DPP-IV    по    сравнению    с    отдельными    пептидами    [24].    
 В    исследованных    работах    показано,    что    стратегии    фракционирования    являются    актуальными    и    осуществимыми    методами,    направленными    на    избирательное    обогащение    ингибирующей    активности    DPP-IV    гидролизатов.    Однако    обычные    лекарственные    средства,    используемые    в    качестве    ингибиторов    DPP-IV,    такие    как    ситаглиптин,    являются    более    сильнодействующими    (IC50    в    наномолярном    диапазоне),    чем    гидролизаты    и    пептиды    сывороточного    белка.    Из    исследований,    приведенных    выше,    можно    сделать    вывод,    что    пептиды,    ингибирующие    DPP-IV    и    идентифицированные    из    гидролизатов,    обычно    имеют    молекулярные    массы    ниже    2    кДа    и    большинство    из    них    содержат    пролиновые    
 
Рисунок    3.    Зависимость    степени    ингибирования    DPP-IV     от    режимов    проведения    гидролиза    ферментами    Протамексом    и    Королазой    2TS Figure    3.    Effect    of    the    modes    of    hydrolysis    by    the    enzymes    Protamex    and    Corolase    2TS    on    the    DPP-IV    inhibition
314
Agarkova E.Yu. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 2, pp. 306–318 и/или    гидрофобные    аминокислотные    остатки    в    своей    последовательности    [15].    Длина,    суммарный    заряд    и    полярность    полученных    из    сыворотки    пептидов    сами    по    себе    не    оказывают    предсказуемого    влияния    на    ингибирующее    действие    или    активность.    Для    ингибирования    DPP-IV    наиболее    важную    роль    играет    аминокислотная    последовательность    
 пептидов    [24].    Исходя    из    результатов    описанных    выше    исследований,    можно    заключить,    что    ферментные    препараты    нейтраза    и    трипсин    продемонстрировали    наилучшую    специфичность    по    отношению    к    расщепляемой    пептидной    связи    сывороточных    белков    и    получение    гидролизатов    с    высокой    ингибирующей    активностью    в    отношении    DPP-IV. Несмотря    на    большое    количество    опубликованных    результатов    исследований    по    выделению,    характеристике    и    биологической    активности    пептидов,    полученных    из    пищевых    белков,    на    рынке    наблюдается    ограниченное    количество    коммерческих    продуктов,    содержащих    биопептиды.    Поэтому    необходимы    дальнейшие    исследования    в    этой    области,    чтобы    установить,    что    белковые    гидролизаты,    которые    считаются    безопасными,    не    проявляют    побочных    эффектов    (особенно    в    высоких    дозах),    включая    токсичность    и    аллергенность.    Гидролизаты    сывороточных    белков    в    104    раза    менее    эффективны,    чем    глиптины.    Тем    не    менее,    при    лечении    диабета    2    типа    комбинации    глиптинов    и    гидролизатов    могут    оказывать    аддитивное    действие    с    точки    зрения    их    способности    ингибировать    
 DPP-IV    [30]. Представленные    в    обзоре    данные    показывают    высокий    потенциал    сывороточных    и    молочных    белков    в    качестве    источников    противодиабетических    пептидов.    Дополнительное    вовлечение    сыворотки    в    производственный    цикл    позволит    не    только    сэкономить    дорогостоящее    сырье    и    расширить    ассортиментный    ряд    функциональных    молочных    продуктов,    но    и    значительно    снизить    затраты    при    ее    утилизации    [33,    34]. Критерии авторства Е.    Ю.    Агаркова    руководила    проектом.    
 К.    А.    Рязанцева    и    А.    Г.    Кручинин    проводили    теоретические    исследования,    участвовали    в    написа- нии    и    корректировке    статьи. Конфликт интересов Авторы    заявляют    об    отсутствии    конфликта    интересов. Contribution E.Yu.    Agarkova    supervised    the    project.    
 K.A.    Ryazantseva    and    A.G.    Kruchinin    conducted    the    theoretical    research,    processed    the    data,    and    prepared    the    manuscript. Conflict of interest The    authors    declare    that    there    is    no    conflict    of    interest    regarding    the    publication    of    this    article.
 

1. Haritonov VD. Deep processing of raw milk materials and secondary resources. Dairy Industry. 2018;(6):30-31. (In Russ.).

2. Kharitonov VD, Ponomareva NV, Melʹnikova EI, Bogdanova EV. Nizkoallergennye molochnye produkty [Low-allergenic dairy products]. St. Petersburg: Professiya; 2019. 108 p. (In Russ.).

3. Torkova AA, Ryazantseva KA, Agarkova EYu, Kruchinin AG, Tsentalovich MYu, Fedorova TV. Rational design of enzyme compositions for the production of functional hydrolysates of cow milk whey proteins. Applied Biochemistry and Microbiology. 2017;53(6):580-591. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.7868/S0555109917060137.

4. Begunova AV, Rozhkova IV, Shirshova TI, Glazunova OA., Fedorova TV. Optimization of conditions for Lactobacillus reuteri LR1 strain cultivation to improve the biosynthesis of bacteriocin-like substances. Biotechnology. 2019;35(5):58-69. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.21519/0234-2758-2019-35-5-58-69.

5. Korhonen H, Pihlanto A. Bioactive peptides: Production and functionality. International Dairy Journal. 2006;16(9): 945-960. DOI: https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2005.10.012.

6. Nasri M. Protein hydrolysates and biopeptides: production, biological activities, and applications in foods and health benefits. A review. Advances in Food and Nutrition Research. 2017;81:109-159. DOI: https://doi.org/10.1016/bs.afnr.2016.10.003.

7. Asafov VA, Tankova HL, Iskakova EL. Functional high protein drink with casein hydrolysate and protein fractions of colostrum. Innovations and Food Safety. 2018;20(2):51-54. (In Russ.).

8. Jia C-L, Hussain N, Ujiroghene OJ, Pang XY, Zhang SW, Lu J, et al. Generation and characterization of dipeptidyl peptidase-IV inhibitory peptides from trypsin-hydrolyzed α-lactalbumin-rich whey proteins. Food Chemistry. 2020;318. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.126333.

9. Tanirbergenova AA, Tulebayev KA, Akanov ZhA. The spread of diabetes in the modern world. Vestnik KazNMU. 2017;(2):386-388. (In Russ.).

10. Kahn SE, Cooper ME, Del Prato S. Pathophysiology and treatment of type 2 diabetes: Perspectives on the past, present, and future. Lancet. 2014;383(9922):1068-1083. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(13)62154-6.

11. Juillerat-Jeanneret L. Dipeptidyl peptidase IV and its inhibitors: Therapeutics for type 2 diabetes and what else? Journal of Medicinal Chemistry. 2013;57(6):2197-2212. DOI: https://doi.org/10.1021/jm400658e.

12. Nongonierma AB, Lalmahomed M, Paolella S, FitzGerald RJ. Milk protein isolate (MPI) as a source of dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) inhibitory peptides. Food Chemistry. 2017;231:202-211. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.03.123.

13. Nongonierma AB, FitzGerald RJ. Inhibition of dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) by proline containing casein-derived peptides. Journal of Functional Foods. 2013;5(4):1909-1917. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jff.2013.09.012.

14. Power O, Nongonierma AB, Jakeman P, FitzGerald RJ. Food protein hydrolysates as a source of dipeptidyl peptidase IV inhibitory peptides for the management of type 2 diabetes. Proceedings of the Nutrition Society. 2014;73(1):34-46. DOI: https://doi. org/10.1017/S0029665113003601.

15. Lacroix IME, Li-Chan ECY. Dipeptidyl peptidase-IV inhibitory activity of dairy protein hydrolysates. International Dairy Journal. 2012;25(2):97-102. DOI: https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2012.01.003.

16. Nongonierma AB, FitzGerald RJ. Dipeptidyl peptidase IV inhibitory properties of a whey protein hydrolysate: Influence of fractionation, stability to simulated gastrointestinal digestion and food-drug interaction. International Dairy Journal. 2013;32(1):33-39. DOI: https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2013.03.005.

17. Lacroix IME, Li-Chan ECY. Inhibition of dipeptidyl peptidase (DPP)-IV and α-glucosidase activities by pepsin-treated whey proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2013;61(31):7500-7506. DOI: https://doi.org/10.1021/jf401000s.

18. Power O, Fernández A, Norris R, Riera FA, FitzGerald RJ. Selective enrichment of bioactive properties during ultrafiltration of a tryptic digest of β-lactoglobulin. Journal of Functional Foods. 2014;9:38-47. DOI: https://doi.org/10.1016/j. jff.2014.04.002.

19. Pellegrini A, Dettling C, Thomas U, Hunziker P. Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin. Biochemical et Biophysical Acta (BBA) - General Subjects. 2001;1526(2):131-140. DOI: https://doi.org/10.1016/ S0304-4165(01)00116-7.

20. Uchida, M, Ohshiba Y, Mogami O. Novel dipeptidyl peptidase-4-inhibiting peptide derived from β-lactoglobulin. Journal of Pharmacological Sciences. 2011;117(1):63-66. DOI: https://doi.org/10.1254/jphs.11089SC.

21. Mares-Mares E, Barboza-Corona JE, Sosa-Morales ME, Gutierrez-Chavez AJ, Gutierrez-Vargas S, Leon-Galvan MF. Inhibition of dipeptidyl peptidase IV by enzymatic hydrolysates derived from primary and secondary whey of fresh and Oaxaca cheeses. International Journal of Dairy Technology. 2019;72(4):626-632. DOI: https://doi.org/10.1111/1471-0307.12623.

22. Silveira ST, Martínez-Maqueda D, Recio I, Hernandez-Ledesma B. Dipeptidyl peptidase-IV inhibitory peptides generated by tryptic hydrolysis of a whey protein concentrate rich in β-lactoglobulin. Food Chemistry. 2013;141(2):1072-1077. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.03.056.

23. Lacroix IME, Li-Chan ECY. Dipeptidyl peptidase-IV inhibitory activity of dairy protein hydrolysates. International Dairy Journal. 2012;25(2):97-102. DOI: https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2012.01.003.

24. Lacroix IME, Li-Chan ECY. Isolation and characterization of peptides with dipeptidyl peptidase-IV inhibitory activity from pepsin-treated bovine whey proteins. Peptides. 2014;54:39-48. DOI: https://doi.org/10.1016/j.peptides.2014.01.002.

25. Le Maux S, Nongonierma AB, FitzGerald RJ. Peptide composition and dipeptidyl peptidase IV inhibitory properties of β-lactoglobulin hydrolysates having similar extents of hydrolysis while generated using different enzyme-to-substrate ratios. Food Research International. 2017;99:84-90. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodres.2017.05.012.

26. Tulipano G, Sibilia V, Caroli AM, Cocchi D. Whey proteins as source of dipeptidyl dipeptidase IV (dipeptidyl peptidase-4) inhibitors. Peptides. 2011;32(4):835-838. DOI: https://doi.org/10.1016/j.peptides.2011.01.002.

27. Nongonierma AB, Dellafiora L, Paolella S, Galaverna G, Cozzini P, FitzGerald RJ. In silico approaches applied to the study of peptide analogs of ile-pro-ile in relation to their dipeptidyl peptidase IV inhibitory properties. Frontiers in Endocrinology. 2018;9. DOI: https://doi.org/10.3389/fendo.2018.00329.

28. Abd El-Salam MH, El-Shibiny S. Separation of bioactive whey proteins and peptides. In: Grumezescu AM, Holban AM, editors. Ingredients Extraction by Physicochemical Methods in Food. Academic Press; 2017. pp. 463-494. DOI: https://doi. org/10.1016/b978-0-12-811521-3.00012-0.

29. Brunetti A, Zito PF, Giorno L, Drioli E, Barbieri G. Membrane reactors for low temperature applications: An overview. Chemical Engineering and Processing - Process Intensification. 2018;124:282-307. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cep.2017.05.002.

30. Guadix A, Camacho F, Guadix EM. Production of whey protein hydrolysates with reduced allergenicity in a stable membrane reactor. Journal of Food Engineering. 2006;72(4):398-405. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2004.12.022.

31. O’Halloran J, O’Sullivan M, Casey E. Production of whey-derived DPP-IV inhibitory peptides using an enzymatic membrane reactor. Food and Bioprocess Technology. 2019;12(5):799-808. DOI: https://doi.org/10.1007/s11947-019-02253-7.

32. Nongonierma AB, Mazzocchi C, Paolella S, FitzGerald RJ. Release of dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) inhibitory peptides from milk protein isolate (MPI) during enzymatic hydrolysis. Food Research International. 2017;94:79-89. DOI: https://doi. org/10.1016/j.foodres.2017.02.004.

33. Donskaya GA, Drozhzhin VM, Bryzgalina VV. Fermented drinks supplemented with whey proteins and water-soluble antioxidants. Vestnik of MSTU. 2018;21(3):471-480. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.21443/1560-9278-2018-21-3-471-480.

34. Zobkova ZS, Fursova TP, Zenina DV, Gavrilina AD, Shelaginova IR, Drozhin VM. Selection of the sources of biologically active substances for functional fermented milk products. Dairy Industry. 2018;(3):59-62. (In Russ.). DOI: https://doi. org/10.31515/1019-8946-2018-3-59-62.