employee from 01.01.2018 to 01.01.2019
Voronezh, Russian Federation
UDK 63 Сельское хозяйство. Лесное хозяйство. Охота. Рыбное хозяйство
Ecosystem degradation forces us to introduce highly productive, environmentally friendly biotechnologies in agricultural production. In this regard, interest in organic farming is growing. Demand for organic products is ahead of supply. This, in its turn, causes interest in substances that, on the one hand, are safe for the environment, and on the other hand, increase yield and quality of crops. These substances include biostimulants. They stimulate the natural processes of assimilation of nutrients, increase stress resistance of plants. In this regard, keratin-containing raw materials deserve special attention, which, in terms of chemical composition, is a protein concentrate (90-95%) . But its use is limited due to the low functionality of the keratin protein of this raw material. Enzymatic keratin hydrolysis will provide a biostimulant for plants with a high content of amino acids. The aim of the study was to develop an enzymatic method for keratin hydrolysis with a high content of amino acids in the final product. Fermentation was carried out by Str. chromogeness.g. 0832 proteinase. The content of soluble protein, peptides and amino acids was carried out photocolorimetrically. Temperature (4000C) and pH (8.0) conditions of Str. chromogeness.g. 0832 enzyme complex have been determined, which allowed further hydrolysis of keratin-containing raw materials with a maximum yield of final products - amino acids (99.57 g/100g). Treatment of corn seeds with the obtained amino acid solution enabled to increase growth-promoting activity by 48%.
biostimulants, keratin-containing raw materials, enzymatic hydrolysis, organic waste, amino acids
Введение. В настоящее время критерием для использования любого производства, любой технологии является защита окружающей среды от загрязнения промышленными, сельскохозяйственными и другими отходами.
Перспективным направлением в последнее время является использование биостимуляторов для выращивания сельскохозяйственной продукции. Они способны значительно сократить время созревания продукции, повысить их качество за счет ускорения процессов поглощения питательных веществ. При этом, являются экологически безопасными стимуляторами, так как имеют природное происхождение.
В связи с этим особого внимания заслуживает кератинсодержащее сырье (источник животного белка кератина). Птицеперерабатывающая отрасль активно развивается. Ежегодные объемы производства птицы увеличиваются в среднем на 12-15 % [7]. Это ведет к накоплению значительных объемов побочного сырья,в том числе, на перо, пух, подкрылок приходится 4,0−5,7 % от общего количества отходов (15,3 – 28,3 %). Кератинсодержащее сырье по химическому составу представляет собой концентрат белка (90-95%) с высоким содержанием незаменимых аминокислот[10,11,13]. Но из-за низкой функциональности белков этого сырья (нерастворимость в воде, высокая механическая прочность, недоступность к действию пищеварительных ферментов и др.) применение этого белка ограничено. Это свойство кератина объясняется наличием большого числа поперечных дисульфидных связей между полипептидными цепями[8,9]. При разрыве этих связей кератин теряет свою устойчивость. Трудности заключаются в том, чтобы перевести этот белок в растворимое состояние, сохраняя при этом все аминокислоты данного белка. В этом случае наиболее приемлемы биотехнологические способы с использованием специфических ферментов, разрушающих компактную структуру кератиновой молекулы до усвояемых компонентов. Решение проблемы позволит получить биостимулятор для растений с высоким содержанием аминокислот.
Исходя из вышеизложенного, целью наших исследований было разработать биотехнологический способ переработки кератиновых отходов птицеперерабатывающей промышленности в ценный белковый продукт, который можно применять в качестве биостимулятора.
Материалы и методы. В качестве объекта исследования использовали перьевые отходы. Ферментным препаратом служила протеиназаStr. chromogeness.g. 0832 [2]. Все опыты проводили с измельченным пером при гидромодуле 1:20. Ферментативный гидролиз проводили в оптимальных для действия фермента условиях (концентрация препарата – 3 ед/г белка). Предварительную обработку кератина проводили тетраборатом натрия в концентрации 0,5% массовых, при давлении – 0,20МПа, продолжительность обработки -2ч. Степень гидролиза определяли как отношение аминного азота к общему. Общий азот определяли по методу Къельдаля, аминный азот определяли спектрофотометрически с использованием 2,4,6 – тринитробензолсульфоновой кислоты. Аминокислотный анализ проводили на аминоанализаторе ААА 399М(Чехия). Протеолитическую активность определяли по ГОСТ 20264.2-88. Содержание растворимого белка, пептидов и аминокислот проводили фотоколориметрически. Предварительно каждую фракцию отделяли. 20 дм3 гидролизата обрабатывали трихлоруксусной кислотой для осаждения непрогидролизованых белков, полученный фильтрат использовали для определения пептидов и аминокислот. Пептиды определяли по биуретовой реакции, аминокислоты – по нингидриновой реакции. В таблицах и рисунках показаны данные, где каждое значение есть среднее из трех определений. При математической обработке результатов использовали критерий Стьюдента. Достоверными считали различия с уровнем значимости q=5%.
Результаты и обсуждение.Общеизвестно, что дисульфидные связи молекулы кератина выполняют стабилизирующую функцию. Реакционная способность этих связей значительно зависит от стерических факторов и электростатического влияния соседних полярных групп[1,5]. Для снижения устойчивости пространственной структуры белковой молекулы необходима предварительная подготовка белка к ферментации.Для этих целей использовали тетраборат натрия, который способствует увеличению выхода растворимых продуктов гидролиза при последующей ферментации. Деструкция кератина кислотами, щелочами, другими реагентами менее предпочтительна, так как ведет к разрушению отдельных аминокислот, превращению некоторых из них из биологически активной L-формы в неактивную D-форму. Растения усваивают α-аминокислоты (протеиногенные) оптически активной L-конфигурации. Последние легко включаются в метаболические процессы клеток растений[3].
Известно, что на эффективность ферментации влияют стабильность фермента и условия протекания реакции [4]. Определение температурного и рН оптимума действия фермента позволит повысить скорость процесса гидролиза.
Оптимальной для действия фермента Streptomyzeschromogeness.g.0832оказалась температура 400С. Протеолитическая активность в этих условия была максимальной и составила 233 ед/мг белка. При увеличении температуры до 50 0С сохраняется до 95% активности фермента. Дальнейшее повышение температуры до 60 и 70 0С сопровождается резким падением активности до 37 и 30 % соответственно (рис.1). Происходит термическаяинактивация фермента, сопровождаемая денатурацией белковой молекулы. Снижение температуры до 300С сопровождалось, также как и в случае с температурой50 0С, незначительной потерей активности и составило 6% от исходного уровня. При 200С потеря протеолитической активности составила уже 44% от максимальной (рис.1). Это явление объясняется изменением активного центра фермента из-за уменьшения плотности воды [4]. Следует отметить, что продолжительность воздействия температуры на ферментный комплекс также играет большую роль на скорость протекания ферментолиза.
Термостабильность фермента определяли при значении рН 8,0 (рис.2) и температурах 30 – 60 0С. Результаты эксперимента показали, что фермент стабилен на протяжении 4 часов при температурах 30 и 400 С. При температурах 50 – 600С остаточная активность уже через 2 ч инкубации снизилась на 45 и 60 % соответсвенно. Результаты наших исследований также подтверждают общую прямую зависимостьмежду скоростью инактивации фермента и степенью денатурации белка. Еще раз доказывая, что влияние температуры на скорость ферментативной реакцииподчиняется уравнению Аррениуса [4].
Зависимость активности фермента от величины рН проводили при температуре 400С в диапазоне 5,0 – 11,0.
Из данных рисунка 3 видно, чтопротеиназа из Str. chromogeness.g. 0832активна в диапазоне рН 7,0 – 9,0.рН – оптимум соответствовал 8,0. Это подтверждает литературные данные, согласно которым кератинрасщепляющиепротеиназы имеют оптимум рН в щелочной области от7,0 до 12,0 [12].
При сдвиге рН как в кислую, так и в щелочную сторону ферментативная активность резко падает. Возможно, конформационные изменения, происходящие в активном центре из-за изменения заряда молекулы фермента, приводят к потере его активности.
Кроме рН-оптимума, важное значение для протекания ферментативной реакции имеет рН-стабильность. Это тот диапазон рН, при котором фермент сохраняет свою активность в течение определенного периода времени.
Исследование рН-стабильности (рис.4), показало, что препарат стабилен в диапазоне рН 8,0-9,0. После 12ч инкубации при температуре 400С потеря активности составила при рН 9,0 – 10 %, при рН 8,0 – 5 %. Инактивация фермента наблюдалась при более кислых (рН 6,0) и щелочных значениях рН (рН 10,0).
Определенные температурные и рН – условия работы ферментного комплекса Str. chromogeness.g. 0832 позволили в дальнейшем провести гидролиз кератинсодержащего сырья с максимальным выходом конечных продуктов - аминокислот.
Гидролиз белка кератина ферментным препаратом из Str. chromogeness.g. 0832 изучали в течение 6 часов. Результаты эксперимента,представленные на рисунке 5, показали, что интенсивное расщепление кератинсодержащего сырья ферментным препаратом Str. chromogeness.g. 0832 происходит за первый час и достигает к 4 – 6 часам наибольшего значения 90-92%. Динамика накопления продуктов гидролиза, представленная в таблице, показывает, что ферментный комплексStreptomyzeschromogeness.g.0832 проявляет высокую специфичность к белку кератину. В основном конечными продуктами гидролиза кератина являются аминокислоты, и уже через 1 ч после ферментации их содержание составило 82,2 % .
Ферментативный гидролиз препаратом Streptomyzeschromogeness.g.0832 позволил получить продукт с высокой биологической ценностью. Аминокислотный состав гидролизатапоказывает, что он содержит все аминокислоты (рис.6). Особенно много в гидролизате было обнаружено глутаминовой кислоты и пролина. Общее количество аминокислот составило 99,57 г/100г, сумма незаменимых аминокислот составила 42,66 г/100г. Сумма серосодержащих аминокислот – 3,72 г/100г.
Большинством ученых доказаны иммуномодулирующие, антистрессовые и регуляторные свойства аминокислот[6]. В связи с этим нами были проведены исследования по влиянию полученного комплекса аминокислот и пептидов из кератина пера на ростостимулирующую активность растений.
Семена кукурузы непосредственно перед высевом в грунт обрабатывали соответствующими растворами в концентрации 0,1 мл/л воды и выдерживали 0,5 часа. Контролем служили необработанные семена. По представленным результатам на рисунке 7 видно, что обработка препаратами на начальных этапах вегетации положительно сказывается на дальнейших этапах роста. Сравнение ростостимулирующей активности предлагаемого биостимулятора с известным препаратом Рибав-Экстра показало, что эффективность полученного препарата выше существующего аналога на 23% и на 48% в сравнении с контролем.
Заключение. Проведенные исследования показали эффективность переработки кератиновых отходов птицеперерабатывающей промышленности в высокоэффективный биостимулятор роста растений. Высокое содержание свободных аминокислот в конечном продукте влияет на повышение урожайности сельскохозяйственных культур. Экологическая безопасность этих препаратов позволит использовать их при выращивании экологически чистых растений.
Рисунок 1. Зависимость протеолитической активности Str. chromogeness.g. 0832 от температуры
(собственные экспериментальные данные и вычисления автора)
Рисунок 2. Влияние температуры на стабильность ферментаStr. chromogeness.g. 0832:
- 300С, 2 – 400С, 3 – 500С, 4 – 600С
(собственные экспериментальные данные и вычисления автора)
Рисунок 3. Зависимость протеолитической активности Str. chromogeness.g. 0832от рН
(собственные экспериментальные данные и вычисления автора)
Рисунок 4. Влияние величины рН на стабильность ферментаStr. chromogeness.g. 0832
(собственные экспериментальные данные и вычисления автора)
Рисунок 5 . Влияние продолжительности ферментативного гидролиза на степень гидролиза пера
(собственные экспериментальные данные и вычисления автора)
Рисунок 6. Аминокислотный состав гидролизата из кератина пера
(собственные экспериментальные данные и вычисления автора)
Таблица
Динамика накопления продуктов ферментативного гидролиза белка кератина
|
Показатель |
Содержание, % в 100 дм³ |
||
|
Продолжительность гидролиза, ч |
растворимый белок |
пептиды |
аминокислоты |
|
0 |
4,2 |
1,4 |
0 |
|
1 |
4,5 |
1,5 |
82,2 |
|
2 |
4,7 |
1,8 |
87,1 |
|
3 |
4,7 |
2,2 |
88,4 |
|
4 |
6,1 |
2,4 |
88,6 |
|
5 |
5,1 |
3,2 |
88,9 |
|
6 |
5,1 |
3,6 |
89,0 |
(собственные экспериментальные данные и вычисления автора)
Рисунок 7. Стимулирование роста растений замачиванием семян в растворе биостимулятора из кератина пера
(собственные экспериментальные данные и вычисления автора)
1. Bortnikov, S.V. Poluchenie rastvorimoy modifikacii keratina iz beloksoderzhaschih othodov zhivotnovodstva/ S.V. Bortnikov, G.A. Gorenkova// Uspehi sovremennogo estestvoznaniya. - 2018. № 4. S. 17-22. - URL:http://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=36719(data obrascheniya: 26.01.2020).
2. Bryndina, L.V. Izuchenie fiziko-himicheskih svoystv fermentnyh sistem flokulyantaStreptomyceschromogeness.g. 0832/ L.V. Bryndina// Ekologiya i promyshlennost' Rossii. - 2012. - №11.- S.48-50.
3. Kretovich, L.V. Biohimiya rasteniy/ L.V. Kretovich. - M.: «Vysshaya shkola», 1986. - 503s.
4. Nel'son D.N. Osnovy biohimii Lenindzhera : v 3 t. T. 1 : Osnovy biohi-mii, stroenie i kataliz / D. Nel'son, M. Koks ; per. s angl. -3-e izd., ispr. - M. : Laboratoriya znaniy,2017. - 694 s. : il. -(Luchshiy zarubezhnyy uchebnik).ISBN 978-5-00101-014-2 (T. 1)ISBN 978-5-00101-013-5V. - URL: http://binom-press.ru/books_1/biology/lenindger_1.pdf (data obrascheniya 25.01.2020).
5. Smirnova,I.R. Funkcional'nyy keratin pera kak istochnik belka i nezamenimyh aminokislot v kormlenii sel'skohozyaystvennoy pticy/ I.R. Smirnova, L.P. Satyukova, M.I. Shopinskaya // Problemy veterinarnoy sanitarii, gigieny i ekologii. - 2016.- №3. - S.78-83.
6. Usvoenie rasteniyami aminokislot/ Agrohimiya. Informacionnyy nekommercheskiy resurs. - URL:http://agrohimija.ru/mikroorganizmy-pochvy/1821-usvoenie-rasteniyami-aminokislot.html(data obrascheniya: 26.01.2020).
7. Volik,V.G.Effektivnoe ispol'zovanie vtorichnogo syr'ya, poluchaemogo pri pererabotke pticy/ V.G. Volik, D. Yu. Ismailova, O.N. Erohina, S.V. Zinov'ev, S.S. Kozak, Yu.E. Muhin, O.V. Koroleva//Ptica i pticeprodukty. - 2011 g.- № 3. -S. 16-19. - URL:http://www.vniipp.ru/images/statya/0311/s16.pdf (data obrascheniya 29.01.2020).
8. Casarin, F.Use of Poultry Byproduct for Production of Keratinolytic Enzymes/F. Casarin,F.Cladera-Olivera, A. Brandelli //Food and Bioprocess Technology. - 2008.-V.1. - P. 301-305.- DOIhttps://doi.org/10.1007/s11947-008-0091-9
9. Gupta, R.Microbial keratinases and their prospective applications: an overview/ R. Gupta, P. Ramnani // Applied Microbiology and Biotechnology.- 2006.- V.170. P. 21-33.-DOIhttps://doi.org/10.1007/s00253-005-0239-8
10. Kirfel, J.Keratins: a structural scaffold with emerging functions/J. Kirfel, T.M.Magin, J. Reichelt //Cellular and Molecular Life Sciences CMLS.- 2003.-V.60.- R. 56-71. -DOIhttps://doi.org/10.1007/s000180300004
11. Körner, A. MALDI MS in Analysis of Keratin Fibre Proteins/A. Körner// Applications of MassSpectrometryin Life Safety.-2008. - P. 205-212.-DOIhttps://doi.org/10.1007/978-1-4020-8811-7_14
12. Characterization of a new keratinolyticTrichodermaatroviride strain F6 that completely degrades native chicken feather/L. Cao, H. Tan, Y. Liu, X. Xue, S. Zhou //Letters inApplied Microbiology. - 2008. -V.46.- P. 389-394.https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2008.02327.x
13. Eremeev, N.L. Enzymatic hydrolysis of keratin-containing stock for obtaining protein hydrolysates/N. L. Eremeev,I. V. Nikolaev, I. D. Keruchen’ko, E. V. Stepanova, A. D. Satrutdinov, S. V. Zinov’ev, D. Yu. Ismailova, V. P. Khotchenkov, N. V. Tsurikova, A. P. Sinitsyn, V. G. Volik, O. V. Koroleva//Applied Biochemistry and Microbiology. - 2009. -V. 45. - No. 6. -R. 717-724. -DOIhttps://doi.org/10.1134/S0003683809060131
