Samara, Russian Federation
p.g.t. Ust'-Kinel'skiy, Samara, Russian Federation
graduate student
Russian Federation
UDK 63 Сельское хозяйство. Лесное хозяйство. Охота. Рыбное хозяйство
GRNTI 68.41 Ветеринария
The aim of the study was to normalize the intestinal microflora of service dogs in the structure of the Ministry of in-ternal Affairs of Russia of Samara division by using BLED-1 synbiotic and dihydroquercetin. The work was carried out in the conditions of Main Department of the Ministry of Internal Affairs of Russia in the Samara Region. Labora-tory studies were conducted on the basis of the Samara State Agricultural Academy in 2018. Service dogs of the German and Belgian Shepherd breed were studied. Fecal specimen of animals were taken before morning feeding and the start of training. Bacterial suspension in successive tenfold dilutions was prepared from fecal specimen. The inoculum was plated into Petrie dishes and tubes for differential diagnostic and elective and selective media. The species composition of the microbiocenosis of the gastrointestinal tract of service dogs contained in the condi-tions of the Samara Main Department of the Ministry of Internal Affairs of Russia, the center of the cynological ser-vice consisted of resident and transient microorganisms. The proportion of Lactobacillus delbrueckii and Bifidobac-teriumbifidum in the microbiocenosis of the gastrointestinal tract of dogs in the control group was 96.00%, while the proportion of opportunistic pathogenic and pathogenic microorganisms was 4.00%. The proportion of Lactobacillus delbrueckii and Bifido bacterium bifidum in the microbiocenosis of the gastrointestinal tract of dogs in the experi-mental group was 97.42%, while the proportion of opportunistic pathogenic and pathogenic microorganisms was 2.58%. This was stipulated by the action of BLED-1 synbiotic and dihydroquercetin under the same conditions of management and training regimes of working dogs. The highest ability to form biofilms was demonstrated by Bifido bacterium bifidum and Lactobacillus delbrueckii. The ability to form biofilms using the BLED-1 synbiotic and di-hydroquercetin was higher with dogs of the experimental group Bifido bacterium bifidum – 80.34±2.18 and Lacto-ba-cillusdel brueckii – 86.12±3.73, and with dogs of the control group amounted to Bifido bacterium bifidum – 67.38±2.64 and Lactobacillus delbrueckii – 73.62±3.18.
dogs, synbiotic, dihydroquercetin, microflora, intestine
Увеличение срока службы собак является актуальной темой, поскольку на ветеринарное обслуживание, воспитание и обучение только одной собаки тратится огромное количество времени, средств и задействуется целый ряд специалистов. При этом у каждого животного своя узкая специализация. Это обуславливает использование большого человеческого и экономического ресурса. Необходимо задействовать эффективные, апробированные и экономически оправданные средства различного происхождения. Одним из таких средств является дигидрокверцетин. Биофлавоноид оказывает бактерицидное воздействие на патогенную и условно-патогенную микрофлору бактерии группы кишечной палочки, сальмонеллы, иерсинии и другие энтеробактерии, стафилококки и стрептококки, листерии и многих других представителей транзиторной микрофлоры, включая микрогрибы [3, 4, 5]. Биофлавоноид дигидрокверцетин (ДГК, DHQ) с химической формулой C15H12O7 в мире известен как Taxifolin (Таксифолин) и считается уникальным антиоксидантом, природным акцептором свободных радикалов кислорода. Дигидрокверцетин является своего рода мощным гепатопротектором, радиопротектором, обладает противовоспалительным, обезболивающим и, самое главное, иммунокоррегирующим свойствами [4, 5].
Пробиотики и синбиотики повышают концентрацию бифидобактерий и лактобацилл в микробиоценозе организма животных и человека [6, 7].
Важным является активация биологических свойств антагонистически активных микроорганизмов, например, энтерококков кишечной микрофлоры животных [10].
Цель исследований – нормализация микрофлоры кишечника служебных собак в структуре ГУ МВД России путем применения синбиотика БЛЭД-1 и дигидрокверцетина.
Задачи исследований ‒ выделение и идентификация у собак микрофлоры желудочно-кишечного тракта; изучение морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, серологических свойств микроорганизмов; определение факторов патогенности и персистенции микроорганизмов при использовании комплекса препаратов экспериментального синбиотика БЛЭД-1 и дигидрокверцетина.
Материал и методы исследований. Работа проводилась в условиях ГУ МВД России по Самарской области. В Центре кинологической службы г. Самары 30 животных. Лабораторные исследования проводились на базе ФГБОУ ВО «Самарская государственная сельскохозяйственная академия» в 2018 г.
Объект исследований – служебные собаки породы немецкая и бельгийская овчарка. Первую группу (контрольную) сформировали из животных, имеющих основной рацион и режим тренировок. Всего в группе было 15 собак (10 голов породы немецкая овчарка, 5 голов породы бельгийская овчарка). Вторую группу (опытную) сформировали из собак, имеющих основной рацион с дополнением дачи экспериментального синбиотика БЛЭД-1 и препарата дигидрокверцетина. Всего в группе
15 собак (10 голов породы немецкая овчарка, 5 голов породы бельгийская овчарка). Условия кормления, содержания и режим тренировок у собак контрольной и опытной групп были одинаковыми. Материал для исследований – пробы фекалий собак.
Экспериментальный синбиотик с инулином и антиоксидантами (дигидрокверцетином и селеном) БЛЭД-1 представляет собой концентрированную взвесь живых микроорганизмов-продуцентов, антиоксиданта и селена. Синбиотик производится согласно ТУ.
Пробы фекалий от животных отбирали до утреннего кормления и начала тренировок. Из проб фекалий готовили баксуспензию в последовательных десятикратных разведениях. Инокулят высевали в чашки Петри и пробирки на дифференциально-диагностические и элективно-селективные среды. Посевы культивировали при 25-37оС в течение 48-72 ч с использованием одноразового стерильного микробиологического г-образного шпателя [9]. Чистые культуры микроорганизмов идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим и серологическим свойствам с использованием штатива для уленгутовских и микроцентрифужных пробирок [8]. Биохимические свойства микроорганизмов изучали постановкой пёстрого ряда со средами Гисса, в пластинах ПБДЭ (пластина для биохимической дифференциации энтеробактерий) и в других специфических тестах, по общепринятым методикам. Определение факторов патогенности микроорганизмов проводили общепринятыми методами.
Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с помощью программ «Биостатистика» и Microsoft Office Excel 2007.
Результаты исследований. Установлено, что общее число микроорганизмов в 1 г фекалий у собак контрольной группы составляло 11,19х1010±0,16. Среди них количество транзиторных микроорганизмов составляло 1,24х106±0,08. Видовой состав микробиоценоза желудочно-кишечного тракта собак контрольной группы состоял из резидентных и транзиторных видов микроорганизмов (табл. 1, 2).
Таблица 1
Резидентные микроорганизмы в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта
собак контрольной группы
|
Культура микроорганизмов |
Количество микроорганизмов, 10n |
|
Enterococcus faecium |
5,13х108±0,21 |
|
Enterococcus faecalis |
2,87х108±0,08 |
|
Enterococcus hirae |
0,82х108±0,06 |
|
Enterococcus flavescens |
0,52х108±0,04 |
|
Enterococcus casseliflavus |
0,22х108±0,03 |
|
Bacteroides fragilis |
3,82х106±0,12 |
|
Bifidobacterium bifidum |
6,58х1010±0,24 |
|
Lactobacillus delbrueckii |
3,98х1010±0,72 |
|
Micrococcus luteus |
6,28х104±0,46 |
|
Streptococcus canis |
7,42х104±0,36 |
|
Prevotella oralis |
5,38х105±0,28 |
|
Escherichia coli |
5,64х104±0,44 |
|
Serratia marcescens |
3,74х105±0,12 |
Таблица 2
Транзиторные микроорганизмы в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта
собак контрольной группы
|
Культура микроорганизмов |
Количество микроорганизмов, 10n |
|
1 |
2 |
|
Citrobacter freundii |
2,48х104±0,42 |
|
Kluyvera cryocrescens |
2,86х104±0,12 |
|
Providencia alcallifaciens |
3,88х104±0,15 |
|
Proteus vulgaris |
4,02х103±0,40 |
|
Morganella morganii |
5,04х103±0,18 |
|
Hafnia alvei |
5,32х104±0,36 |
|
Окончание табл. 2 |
|
|
1 |
2 |
|
Erwinia amylovora |
3,42х104±0,08 |
|
Enterobacter cloacae |
5,14х104±0,28 |
|
Klebsiella oxytoca |
4,06х104±0,42 |
|
Yersinia enterocolitica |
0,22х103±0,02 |
|
Salmonella enteritidis |
1,24х103±0,06 |
|
Helicobacter pylori |
5,26х104±0,32 |
|
Staphylococcus aureus |
2,74х105±0,12 |
|
Streptococcus pneumoniae |
6,38х105±0,16 |
В контрольной группе в ходе изучения микрофлоры кишечника у двух собак была выделена культура патогенных стафилококков Staphylococcus aureus, сапрофитная культура микрококков Micrococcus luteus, условно-патогенная культура превотелл Prevotellaoralis. В ходе изучения у всех собак была выделена условно-патогенная культура стрептококков Streptococcus pneumoniae и условно-патогенная культура Streptococcus canis. В ходе исследования фекалий у четырёх собак контрольной группы выделена условно-патогенная культура Helicobacter pylori, у всех собак выявлены условно-патогенные энтеробактерии Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, а также энтерококки, сапрофиты лактобациллы Lactobacillus delbrueckii, бифидобактерий Bifidobacterium bifidum. Данные культуры микроорганизмов также выявлялись авторами ранее в ходе исследования резидентной и транзиторной микрофлоры собак в условиях Самарской области [1, 2].
В опытной группе собак общее число микроорганизмов в 1 г фекалий было на уровне 16,69х1010±0,23. Среди них количество транзиторных микроорганизмов составляло 2,51х105±0,08. Видовой состав микробиоценоза желудочно-кишечного тракта собак опытной группы представлен в таблицах 3 и 4.
Таблица 3
Резидентные культуры микроорганизмов в видовом составе микробиоценоза
желудочно-кишечного тракта служебных собак опытной группы
|
Культура микроорганизмов |
Количество микроорганизмов, 10n |
|
Enterococcus faecium |
5,72х108±0,58 |
|
Enterococcus faecalis |
3,08х108±0,12 |
|
Enterococcus hirae |
1,52х108±0,04 |
|
Enterococcus flavescens |
0,74х108±0,02 |
|
Enterococcus casseliflavus |
0,44х108±0,04 |
|
Bacteroides fragilis |
3,82х106±0,26 |
|
Bifidobacterium bifidum |
9,52х1010±0,64 |
|
Lactobacillus delbrueckii |
6,74х1010±0,26 |
|
Micrococcus luteus |
7,16х105±0,32 |
|
Prevotella oralis |
3,14х103±0,52 |
|
Escherichia coli |
5,22х104±0,23 |
|
Serratia marcescens |
4,62х105±0,18 |
|
Leptotrichia buccalis |
4,16х104±0,22 |
Таблица 4
Транзиторные микроорганизмы в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта
собак опытной группы
|
Культура микроорганизмов |
Количество микроорганизмов, 10n |
|
Citrobacter freundii |
3,02х104±0,12 |
|
Kluyvera cryocrescens |
2,82х104±0,24 |
|
Providencia alcallifaciens |
3,44х104±0,28 |
|
Proteus vulgaris |
4,26х103±0,38 |
|
Morganella morganii |
4,12х103±0,12 |
|
Hafnia alvei |
3,74х104±0,38 |
|
Erwinia amylovora |
3,54х104±0,20 |
|
Enterobacter cloacae |
5,06х104±0,18 |
|
Klebsiella oxytoca |
2,63х104±0,08 |
|
Yersinia enterocolitica |
0,26х103±0,02 |
|
Salmonella enteritidis |
0,45х103±0,08 |
В опытной группе у собак в ходе изучения микрофлоры кишечника была выделена сапрофитная культура микрококков Micrococcus luteus, условно-патогенная культура превотелл Prevotella oralis,условно-патогенная культура лептотрихий Leptotrichia buccalis. Культура патогенных стафилококков Staphylococcus aureus выделена не была.
У собак опытной группы в пробах фекалий условно-патогенная культура Helicobacter pylori отсутствовала, были выделены условно-патогенные энтеробактерии Escherichia coli, Enterobacter cloacae, энтерококки, сапрофиты лактобациллы Lactobacillus delbrueckii и бифидобактерии Bifidobacterium bifidum.
В ходе исследования биохимических и серологических свойств у культур энтерококков, выделенных авторами от служебных собак, желатиназная активность и гемолитическая активность не выявлена. Это свидетельствует об отсутствии данных факторов патогенности (вирулентности) у выделенных энтерококков. К факторам патогенности (вирулентности) относят определённую группу протеолитических ферментов, продуцируемыми энтерококками. Высокая активность протеолитических ферментов у представителей рода Enterococcus является важнейшим инструментом антагонистической способности по отношению к патогенным микроорганизмам. В ходе исследования установлено, что все выделенные и идентифицированные культуры энтерококков обладали протеолитической активностью (табл. 5, 6). При этом у собак опытной группы протеолитическая активность энтерококков была менее выражена, чем у энтерококков собак контрольной группы.
Таблица 5
Протеолитическая активность культур энтерококков у собак контрольной группы
|
Культура Enterococcus sp. |
Протеолитическая активность, мг∙мл/мин |
|
Enterococcus faecium |
0,96±0,016 |
|
Enterococcus hirae |
0,58±0,012 |
|
Enterococcusfaecalis |
0,74±0,014 |
|
Enterococcus flavescens |
0,68±0,012 |
|
Enterococcus casseliflavus |
0,42±0,024 |
Таблица 6
Протеолитическая активность культур энтерококков у собак опытной группы
|
Культура Enterococcus sp. |
Протеолитическая активность, мг∙мл/мин |
|
Enterococcus faecium |
0,62±0,004 |
|
Enterococcus hirae |
0,34±0,008 |
|
Enterococcus faecalis |
0,56±0,006 |
|
Enterococcus flavescens |
0,45±0,005 |
|
Enterococcus casseliflavus |
0,27±0,003 |
Среди факторов персистенции антилизоцимная и антикарнозиновая активность выявлены только у культур энтерококков. Основными показателями, определяющими персистентные свойства микроорганизмов, являются антилизоцимная активность, антикарнозиновая активность и способность к образованию биоплёнок.
В результате исследования антилизоцимной активности у представителей рода Enterococcus выявлено, что данный признак встречался у 100% изолятов, выделенных от служебных собак. Уровень проявления антилизоцимной активности был более высоким у изолятов Enterococcus hirae, а наименьшим – у изолятов Enterococcus casseliflavus (табл. 7, 8). При этом у собак опытной группы антилизоцимная активность энтерококков была меньше по сравнению с антилизоцимной активностью энтерококков собак контрольной группы.
Таблица 7
Антилизоцимная активность энтерококков, выделенных от собак контрольной группы
|
Культура Enterococcus sp. |
Антилизоцимная активность, мкг/мл∙ед |
|
Enterococcus faecium |
2,37±0,018 |
|
Enterococcus hirae |
3,46±0,004 |
|
Enterococcus faecalis |
2,16±0,008 |
|
Enterococcus flavescens |
1,68±0,012 |
|
Enterococcus casseliflavus |
1,25±0,007 |
Таблица 8
Антилизоцимная активность энтерококков, выделенных от собак опытной группы
|
Культура Enterococcus sp. |
Антилизоцимная активность мкг/мл∙ед |
|
Enterococcus faecium |
1,85±0,012 |
|
Enterococcus hirae |
2,58±0,010 |
|
Enterococcus faecalis |
1,63±0,009 |
|
Enterococcus flavescens |
1,22±0,008 |
|
Enterococcus casseliflavus |
0,54±0,002 |
Выживание условно-патогенных бактерий реализуется через их способность к адаптации и инактивации защитных свойств макроорганизма. Дипептид природного происхождения карнозин
(β-аланил L-гистидин) является одним из основных факторов неспецифической реактивности организма человека и животных. Все изоляты энтерококков, выделенные от служебных собак, обладали антикарнозиновой активностью. Уровень проявления антикарнозиновой активности был более высоким у изолятов Enterococcus hirae, а наименьшим – у изолятов Enterococcus casseliflavus
(табл. 9, 10). Антикарнозиновая активность энтерококков собак опытной группы была менее выраженной по сравнению с антикарнозиновой активностью энтерококков собак контрольной группы.
Таблица 9
Антикарнозиновая активность культур энтерококков у собак контрольной группы
|
Культура Enterococcus sp. |
Антикарнозиновая активность, мг/мл |
|
Enterococcus faecium |
2,76±0,015 |
|
Enterococcus hirae |
3,42±0,014 |
|
Enterococcus faecalis |
2,47±0,013 |
|
Enterococcus flavescens |
1,36±0,010 |
|
Enterococcus casseliflavus |
1,28±0,008 |
Таблица 10
Антикарнозиновая активность культур энтерококков у собак опытной группы
|
Культура Enterococcus sp. |
Антикарнозиновая активность мг/мл |
|
Enterococcus faecium |
1,43±0,012 |
|
Enterococcus hirae |
2,38±0,016 |
|
Enterococcus faecalis |
1,56±0,015 |
|
Enterococcus flavescens |
1,08±0,012 |
|
Enterococcus casseliflavus |
0,32±0,002 |
Одним из важнейших биологических свойств микроорганизмов, способствующих их адаптации и переживаемости в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта животных и человека, является способность к образованию биоплёнок. Способность к образованию биоплёнок выявлена у всех резидентных микроорганизмов, идентифицированных у собак. При этом способность к образованию биоплёнок у микроорганизмов собак опытной группы была значительно выше, чем у микробов собак контрольной группы (табл. 11, 12).
Таблица 11
Способность образовывать биоплёнки микробами у собак контрольной группы
|
Микроорганизмы |
Способность образовывать биоплёнки, % |
|
Enterococcus faecium |
25,34±1,38 |
|
Enterococcus hirae |
41,48±1,55 |
|
Enterococcus faecalis |
21,44±1,46 |
|
Enterococcus flavescens |
19,82±1,16 |
|
Enterococcus casseliflavus |
18,22±1,08 |
|
Bacteroides fragilis |
15,24±1,06 |
|
Bifidobacterium bifidum |
67,38±2,64 |
|
Lactobacillus delbrueckii |
73,62±3,18 |
|
Micrococcus luteus |
31,15±2,83 |
|
Streptococcus canis |
18,27±1,52 |
|
Prevotella oralis |
16,38±1,04 |
|
Escherichia coli |
48,77±2,59 |
|
Serratia marcescens |
28,45±1,72 |
Таблица 12
Способность образовывать биоплёнки микроорганизмами у собак опытной группы
|
Микроорганизмы |
Способность образовывать биоплёнки, % |
|
Enterococcus faecium |
37,12±1,45 |
|
Enterococcus hirae |
63,74±3,63 |
|
Enterococcus faecalis |
42,78±2,33 |
|
Enterococcus flavescens |
30,58±1,68 |
|
Enterococcus casseliflavus |
33,67±1,92 |
|
Bacteroides fragilis |
20,13±1,34 |
|
Bifidobacterium bifidum |
80,34±2,18 |
|
Lactobacillus delbrueckii |
86,12±3,73 |
|
Micrococcus luteus |
38,45±2,13 |
|
Streptococcus canis |
22,64±1,33 |
|
Prevotella oralis |
20,19±1,59 |
|
Escherichia coli |
57,13±2,44 |
|
Serratia marcescens |
35,62±1,98 |
|
Leptotrichia buccalis |
29,43±1,75 |
Способность к образованию биоплёнок была наиболее высокой у Bifidobacterium bifidum
и Lactobacillus delbrueckii. Способность к образованию биоплёнок в результате применения дигидрокверцетина и синбиотика БЛЭД-1 у собак опытной группы у культуры Bifidobacterium bifidum составила 80,34±2,18 и Lactobacillus delbrueckii − 86,12±3,73, у собак контрольной группы была ниже:
у культуры Bifidobacterium bifidum – 67,38±2,64 и Lactobacillus delbrueckii − 73,62±3,18.
Заключение. Комплекс препаратов синбиотик БЛЭД-1 и дигидрокверцетин оказал положительное влияние на микрофлору организма служебных собак. Это привело к подавлению жизнедеятельности транзиторных патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в микробиоценозе животных. В результате у собак возросла численность полезной сапрофитной микрофлоры (Bifidobacterium bifidum и Lactobacillus delbrueckii), участвующей в процессе обмена энергии и веществ, а также оказывающей, в том числе, антиоксидантное и бактерицидное действие на стороннюю микрофлору.
1. Ermakov, V. V. (2013). Rezidentnaia I tranzitornaia mikroflora brodiachih koshek I sobak v usloviiakh Samar-skoi oblasti [the Resident and transient microflora of cats stray dogs and in the conditions of Samara region]. Izvesti-ia Samarskoi gosudarstvennoi selskokhoziaistvennoi akademii - Bulletin Samara state agricultural academy, 1, 15-19 [in Russian].
2. Ermakov, V. V., & Kurlykova, Yu. A. (2018). Effektivnost iprobiotika baktistatina v komplekse s digidrokver-cetinom na mikrobiocenoz sobak pri transmissivnoi venericheskoi sarkomoi [The effectiveness of the probiotic bak-tistatin in combination with dihydroquercetin on the microbiocenosis of dogs in transmissible venereal sarcoma]. Izvestiia Samarskoi gosudarstvennoi selskokhoziaistvennoi akademii - Bulletin Samara state agricultural academy, 2, 40-46 [in Russian].
3. Batanov, A. Yu., Batanov, S. D., & Krasnov, O. A. (2011). Vliianiie antioksidantov na rost i interierniie pokazateli remontnogo molodniaka krupnogo rogatogo skota [Influence of antioxidants on growth and interior indicators of reparative young cattle]. Agrarnaya nauka - Agrarian science, 10, 23-24 [in Russian].
4. Bizyuk, L. A., & Korolevich, M. P. (2013). Antioksidant digidrokvercetin - kliniko-farmakologicheskaia effek-tivnost i puti sinteza [Antioxidant dihydroquercetin clinical-pharmacological efficacy and routes of synesis]. Lechebnoe delo - Medical business, 1 (29), 13-19 [in Russian].
5. Bovkun, G. F., & Ovseenkov, Yu. V. (2014). Ispolizovanie digidrokvercetina flavit i ego smesi s probiotikom pri virashchivanii broilerov [The use of dihydroquercetin flavite and its mixtures with probiotic for growing broilers]. Vestnik Brianskoi seliskokhoziaistvennoi akademii - Bulletin of the Bryansk agricultural Academy, 2, 22-27 [in Rus-sian].
6. Kalashnikova, V. A., & Sultanova, O. A. (2018). Monitoring kishechnikh zabolevanii i analiz spektra kishechnoi mikroflori u obeziian [Monitoring of intestinal diseases and analysis of the spectrum of intestinal microflora in mon-keys]. Veterinariia i kormleniie - Veterinaria i kormlenie, 1, 37-39 [in Russian].
7. Lukyanchikova, E., & Shelamova, S. (2016). Optimizaciia mikroflori kishechnika - put k povisheniiu produk-tivnosti [Optimization of intestinal microflora - a way to increase productivity]. Svinovodstvo - Pigbreeding, 3, 65-67 [in Russian].
8. Ermakov, V. V., & Kotov, D. N. (2018). Shtativ dlia ulengutovskikh i mikrocentrifuzhnikh probirok [Tripod for Ulengutov and microcentrifuge tubes]. Patent 184921 Russian Federation, IPC B01L 9/06, A 61B 10/02, № 2018125607 [in Russian].
9. Ermakov, V.V. (2016). Odnorazovii sterilinii microbiologicheskii g-obraznii shpatel [Disposable, sterile micro-biological g-shaped spatula]. Patent 163081 the Russian Federation, IPC C12M 1/14, A 61B 10/02, №2016100537/14 [in Russian].
10. Shchepitova, N. E., Sycheva, M. V., & Kartashova, O. L. (2014). Biologicheskie svoistva antagonisticheski ak-tivnikh enterokokkov kishechnoi mikroflori zhivotnikh [Biological properties of antagonistically active enterococci of the intestinal microflora of animals]. Vestnik Orenburgskogo gosudarstvennogo universiteta - Vestnik Orenburg state University, 13 (174), 134-138 [in Russian].
