Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
Blagoveshchensk, Russian Federation
Holodovye receptory TRPM8 shiroko ekspressirovany v respiratornom trakte cheloveka i sposobny oposredovat' vospalitel'nyy i sekretornyy otvet pri ohlazhdenii. Cel'yu issledovaniya bylo izuchit' ekspressiyu TRPM8 na urovne mRNK v kletkah nazal'nogo epiteliya u bol'nyh bronhial'noy astmoy (BA) s holodovoy giperreaktivnost'yu dyhatel'nyh putey (HGDP). V issledovanii prinyali uchastie 54 cheloveka, v tom chisle 36 bol'nyh BA i 18 pacientov s hronicheskim neobstruktivnym bronhitom. Vsem bol'nym vypolnyalas' proba s 3-minutnoy izokapnicheskoy giperventilyaciey holodnym vozduhom (IGHV) cherez rot i cherez nos. Ekspressiya issledovalas' v brash-bioptatah epiteliya, poluchennyh do i posle nazal'noy proby s IGHV, metodom kolichestvennoy PCR s obratnoy transkripciey. Ustanovleno, chto ishodnaya ekspressiya TRPM8 uvelichena u kuril'schikov, odnako ne svyazana s funkciey legkih u bol'nyh BA. HGDP soprovozhdaetsya uvelicheniem ekspressii TRPM8 v 3,3 raza (p=0,03). Krome togo, bazal'nyy uroven' ekspressii obratno korreliruet so stepen'yu snizheniya pokazateley funkcii vneshnego dyhaniya v otvet na probu s IGHV kak sredi bol'nyh BA (ΔOFV1 ρ=-0,37, p=0,02), tak i v obschey gruppe (ΔOFV1 ρ=-0,33, p=0,01). Po-vidimomu, deystvie holoda in vivo vyzyvaet adaptivnuyu reakciyu snizheniya transkripcii TRPM8, chto osobenno horosho proslezhivaetsya u bol'nyh sredney persistiruyuschey BA (snizhenie v 3,2 raza, p=0,02). Neobhodimo dal'neyshee izuchenie diagnosticheskogo i prognosticheskogo potenciala opredeleniya ekspressii TRPM8 pri ocenke formirovaniya HGDP u bol'nyh hronicheskoy obstruktivnoy patologiey legkih
bronhial'naya astma, holod, giperreaktivnost' dyhatel'nyh putey, vospalenie, ekspressiya, TRPM8, epiteliy
Многочисленные данные, накопленные за последние десятилетия, не оставляют сомнений в том, что климатические факторы могут оказывать существенное неблагоприятное влияние на течение хронической обструктивной патологии респираторного тракта. При этом, большинство исследователей сходятся во мнении, что низкая температура атмосферного воздуха является одним из основных климатических факторов, вызывающих обострение симптоматики у больных бронхиальной астмой (БА) и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) [4]. Так, в одном из исследований было обнаружено достоверное увеличение частоты госпитализаций по поводу обострений БА при снижении среднесуточной температуры [13]. В другой аналогичной работе авторами была показана сезонность обострений ХОБЛ и обратная взаимосвязь их частоты с температурой воздуха. При этом температура являлась единственным фактором, объясняющим рост частоты обострений, даже после коррекции эффекта на уровень влажности воздуха, осадков, пылевого загрязнения и заболеваемости гриппом. Снижение температуры на каждый градус сопровождалось достоверным увеличением частоты госпитализаций у больных ХОБЛ на 4,7% в неделю [3]. Ежедневные колебания температуры также увеличивают риск госпитализаций у больных БА. По результатам многолетнего наблюдения прирост вариабельности суточной температуры на каждый градус был ассоциирован с увеличением частоты госпитализаций на 2,49% в сутки [10].
Несмотря на очевидную взаимосвязь симптомов БА с температурными условиями, патогенетические механизмы данного явления не были до конца раскрыты. В этом аспекте все больше внимания привлекают катионные каналы с транзиторным рецепторным потенциалом (TRP), некоторые из которых являются естественными рецепторами температуры. В частности, тетрамерный канал TRPM8 выполняет роль основного холодового рецептора с температурой активации 31-32ºC [5], и экспрессируется в различных отделах респираторного тракта. Примечательно, что TRPM8, являясь холодовым рецептором, также способен опосредовать воспалительный и секреторный ответ клетками респираторного эпителия, что может иметь важное значение в индукции симптомов у больных БА и ХОБЛ под действием низкой температуры [7, 11].
В последнее время TRPM8 также часто рассматривается в качестве возможной мишени для фармакологической модуляции при различных состояниях, при участии крупных фармацевтических компаний были синтезированы его высокоселективные антагонисты [6]. Однако, учитывая патогенетическую гетерогенность таких многофакторных заболеваний, как БА, а также широкий спектр эффектов, сопровождающих активацию TRPM8, применение данных препаратов может потребовать персонализированного подхода с анализом индивидуальных молекулярных характеристик заболевания. В связи с этим, прежде нами были идентифицированы полиморфизмы гена TRPM8 определяющие предрасположенность к формированию холодовой гиперреактивности дыхательных путей (ХГДП) [2], а также изучена экспрессия белка TRPM8 на бронхиальных макрофагах и назальном эпителии больных БА [1].
Целью данного исследования было установить взаимосвязь особенностей экспрессии гена TRPM8 в назальном эпителии на уровне мРНК с наличием ХГДП у больных БА.
Материалы и методы исследования
В исследование были включены 54 человека, в том числе 36 больных БА и 18 пациентов с хроническим необструктивным бронхитом (ХНБ). Среди обследованных преобладали женщины (67%). Средний возраст участников исследования составил 38,9±1,72 лет. Среди больных БА наибольшую долю составляли пациенты с персистирующим заболеванием средней (64%) и легкой тяжести (33%). При проведении исследования руководствовались принципами Хельсинкской декларации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования» с поправками 2013 г. и нормативными документами «Правила надлежащей клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом №200 от 01.04.2016 МЗ РФ. Больные подписывали информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с протоколом, одобренным локальным Комитетом по биомедицинской этике.
Исследование функции внешнего дыхания проводили методом спирографии при форсированном выдохе с анализом кривой поток-объем на аппарате FlowScreen (Erich-Jaeger, Германия). Параметры функции внешнего дыхания, определяемые при спирометрии, включали объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1), форсированную жизненную емкость легких (ФЖЕЛ), индекс Тиффно (ИТ), пиковую объемную скорость (ПОС), мгновенную объёмную скорость после выдоха 50% ФЖЕЛ (МОС50) и 75% ФЖЕЛ (МОС75), а также параметр МОС25-75, дающий интегральную оценку проходимости средних и мелких бронхов. Спирометрическое исследование выполняли исходно, а также после проведения бронхопровокационной пробы с 3-минутной изокапнической гипервентиляцией холодным воздухом (ИГХВ). Гипервентиляцию воздушной смесью с температурой -20ºС, содержащей 5% СО2, проводили на уровне 60% от должной максимальной вентиляции. На основании полученных данных о проходимости дыхательных путей вычисляли процентное отношение изменения (Δ, %) для параметров ФЖЕЛ, ОФВ1, ПОС, МОС50 и МОС75, а также ИТ. При снижении ОФВ1 на 10% и более или снижении МОС50 на 25% и более по отношению к исходному диагностировали ХГДП.
Назальную гипервентиляцию холодным воздухом выполняли в течение 3 мин. аналогично бронхопровокационной пробе с ИГХВ, но с использованием носовой маски вместо загубника. За 12 часов исключалось использование больным препаратов базисной терапии, а за 2 часа – назальных спреев и капель. Кроме этого, до пробы исключалась экспозиция с физико-химическими стимулами, способными вызвать секреторный ответ.
Обратимость бронхиальной обструкции выявляли спирометрически через 15 мин. после ингаляции бронхолитика (сальбутамол 400 мкг). Прирост ОФВ1 на 12% и более в ответ на ингаляцию расценивался как положительная бронходилатационная проба.
Образцы эпителия собирали методом браш-биопсии с использованием цитощеток из нижней носовой раковины под риноскопическим контролем непосредственно перед проведением пробы с назальной холодовой гипервентиляцией и через 15 мин. после ее завершения. Перед выполнением манипуляции больному предлагалось очистить носовые ходы. Немедленно после взятия, клетки смывали в RL-буфер и замораживали при -80°C до момента выделения РНК. Выделение РНК производили наборами «Total RNA Purification Kit» (Norgen Biotek, Канада) согласно протоколу производителя. Предварительную оценку качества РНК производили методом электрофореза образца в 1% агарозном геле с дальнейшим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией на трансиллюминаторе. В качественных образцах отмечалась хорошая визуализация 28S и 18S рРНК с соотношением интенсивности полос 2:1. Концентрацию РНК определяли на флуориметре Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США).
Определение экспрессии TRPM8 было возможно только при проведении обратной транскрипции с ген-специфическим праймером. Для проведения обратной транскрипции использовали набор ОТ-1 (Синтол, Россия). Смесь 5 мкл РНК (1-2 мкг общей РНК), раствора трегалозы, и комбинации Олиго(dT)15 и ген-специфического праймеров, инкубировали в течение 5 мин. при температуре 65ºС, охлаждали на льду 1 мин., после чего добавляли 2,5Х реакционную смесь и ревертазу MMLV-RT. Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл. Трегалозу добавляли в раствор до конечной концентрации 0,6M с целью стабилизации ревертазы, ген-специфический праймер – до 0,2 мкМ, праймер Олиго(dT)15 – в количестве, рекомендованном производителем набора. Обратную транскрипцию проводили при температуре 60ºС в течение часа. Полученную кДНК хранили при -20ºС.
Оценку экспрессии TRPM8 проводили методом количественной ПЦР в реальном времени в присутствии интеркалирующего красителя EvaGreen (Синтол, Россия). В качестве референсного использовали ген B2M.
Смесь для ПЦР TRPM8 включала в себя: кДНК-матрица 100 нг; 1х ПЦР-буфер, содержащий EvaGreen, MgCl2 – 2,5 мМ, dNTP 0,25 мМ, праймеры – прямой (на экзон-экзонном стыке) 5’-CATGGAGTCTTCTGTCTGCTGTTTC-3’, обратный − 5’-GTGTCGTTGGCTTTTGTGTTGAT-3’ – по 0,2 мкМ каждого, Hot Start Taq-полимераза, ингибированная антителами – 1 ЕД, вода – до 25 мкл. Амплификацию проводили в режиме: предварительная денатурация – 95ºС/1,5 мин., 40 циклов – денатурация 92°C/5 сек., отжиг при 65ºC/10 сек., элонгация при 72ºC/10 сек.
Смесь для ПЦР B2M включала в себя: кДНК-матрица 100 нг; 1х ПЦР-буфер, содержащий EvaGreen, MgCl2 – 2,0 мМ, dNTP 0,25 мМ, праймеры – прямой 5’- CCGTGTGAACCATGTGACTTTGT-3’, обратный (на экзон-экзонном стыке) − 5’-TGCGGCATCTTCAAACCTCC-3’ – по 0,2 мкМ каждого, Hot Start Taq-полимераза, ингибированная антителами – 1 ЕД, вода – до 25 мкл. Амплификацию проводили в режиме: предварительная денатурация – 95ºС/1,5 мин., 40 циклов – денатурация 92ºC/5 сек., отжиг при 62ºC/10 сек., элонгация 72ºC/10 сек.
Амплификацию образцов для каждого гена выполняли в трехкратных повторах. Из трех полученных значений пороговых циклов (Ct) вычисляли среднее арифметическое для каждого случая. Сравнительный анализ экспрессии выполняли методом 2^-ΔΔCT.
Статистические расчеты выполняли в программном пакете Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., 2011) с использованием параметрических и непараметрических методов. Анализ количественных переменных с нормальным распределением проводили методом t-Стьюдента. В случае распределения, отличного от нормального, использовали U критерий Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили с использованием критерия ранговой корреляции Спирмена. Для ассоциативного анализа номинальных переменных использовали критерий χ2 Пирсона или точный критерий Фишера. Данные представлены в виде M±m для нормально распределенных переменных и Me (Q1; Q3) – для переменных с распределением, отличным от нормального. Уровень значимости равный 0,05 принимали в качестве критического.
Результаты исследования и их обсуждение
ХГДП, диагностированная в соответствии с вышеприведенными критериями, была характерна исключительно для больных БА и встречалась в 36% случаев. Краткая сравнительная характеристика подгрупп пациентов в зависимости от наличия ХГДП приведена в таблице.
Таблица
Сравнительная характеристика групп больных БА в зависимости от наличия ХГДП
|
Параметр |
Наличие ХГДП (n=13) |
Отсутствие ХГДП (n=23) |
p |
|
|
Возраст, лет |
38,8±3,78 |
40,4±2,53 |
>0,05 |
|
|
Пол: мужской / женский, % |
54 / 46 |
22 / 78 |
0,05 |
|
|
Индекс курильщика |
не курящие - % |
62 |
74 |
>0,05 |
|
до 10 пачка-лет, % |
23 |
22 |
||
|
10 и более пачка-лет, % |
15 |
4 |
||
|
Функция легких |
ОФВ1, % |
95,5±3,38 |
91,4±2,91 |
>0,05 |
|
ФЖЕЛ, % |
106,2±2,21 |
98,6±2,63 |
0,05 |
|
|
ИТ, % |
89,3±3,94 |
93,6±2,04 |
>0,05 |
|
|
Реакция на бронхолитик (ΔОФВ1), % |
7,0 (3,2; 15,0) |
8,0 (4,0; 14,0) |
>0,05 |
|
|
Реакция на холодовую бронхопровокацию (ΔОФВ1), % |
-12,0 (-18,0; -10,4) |
-3,0 (-6,0; -1,0) |
<0,001 |
|
|
Тяжесть БА |
Интермиттирующая, % |
0 |
4 |
>0,05 |
|
Легкая, % |
23 |
40 |
||
|
Средняя, % |
77 |
56 |
||
У больных БА уровень экспрессии TRPM8 был в 1,5 раза выше, по сравнению с лицами контрольной группы, а при средней персистирующей БА экспрессия была в 1,5 раза выше, чем при легком и интермиттирующем течении заболевания (p>0,05). Тем не менее, какой-либо взаимосвязи экспрессии с показателями функции внешнего дыхания найдено не было. Курение было ассоциировано с 3-кратным увеличением экспрессии TRPM8 вне зависимости от диагноза (p=0,04).
Среди больных БА наличие ХГДП сопровождалось 3,3-кратным увеличением экспрессии TRPM8 в назальном эпителии (p=0,03). Кроме этого, исходный уровень экспрессии достоверно коррелировал со степенью снижения показателей вентиляционной функции легких в ответ на ИГХВ (ΔОФВ1 ρ=-0,37, p=0,02; ΔФЖЕЛ ρ=-0,36, p=0,03; ΔПОС ρ=-0,43, p=0,01; ΔМОС50 ρ=-0,36, p=0,03; ΔМОС25-75 ρ=-0,38, p=0,02) (рис.). У больных ХНБ аналогичная зависимости также прослеживалась, но была не значима (ΔОФВ1 ρ=-0,23, p>0,05), ввиду меньшего числа наблюдений и отсутствия случаев ХГДП. При этом, при анализе в общей выборке, значимость обратной ассоциации уровня экспрессии с динамикой спирометрических показателей при холодовом воздействии сохранялась (ΔОФВ1 ρ=-0,33, p=0,01; ΔФЖЕЛ ρ=-0,24, p=0,08; ΔПОС ρ=-0,32, p=0,02; ΔМОС50 ρ=-0,32, p=0,02; ΔМОС25-75 ρ=-0,33, p=0,02).
Рис. Обратная корреляция экспрессии мРНК TRPM8 в назальном эпителии больных БА (натуральный логарифм индивидуальных значений 2-ΔCt) и реакции дыхательных путей на холод (отношение динамики ОФВ1 в ответ на пробу с ИГХВ по отношению к исходному значению (ΔОФВ1, %)). Более высокая экспрессия TRPM8 чаще сопровождается выраженным нарушением проходимости бронхов после холодового воздействия (ρ=-0,37, p=0,02).
После ИГХВ в общей группе экспрессия TRPM8 снижалась в 1,5 раза (p=0,2) по сравнению с исходным уровнем, при этом среди больных БА снижение было несколько более выраженным (в 1,7 раза, p=0,1), а у больных БА средней тяжести происходило значимое снижение экспрессии TRPM8 (в 3,2 раза, p=0,02). Статус ХГДП не влиял на динамику экспрессии TRPM8 под влиянием холода.
Реактивность дыхательных путей на бронхолитик не зависела от уровня экспрессии TRPM8.
Полученные результаты согласуются с ранее произведенными наблюдениями. Так, up-регуляция TRPM8 прежде была обнаружена у больных ХОБЛ [7]. Кроме этого, ранее был показан стимулирующий эффект сигаретного дыма на транскрипцию гена в условиях in vitro, что сопровождалось увеличением экспрессии TRPM8 как на уровне мРНК, так и белка [12]. Тем не менее, в отличие от экспериментальных данных, полученных на эпителиоидных клетках 16HBE, в нашем исследовании у больных БА отмечалось снижение экспрессии TRPM8 под действием низкой температуры. В наибольшей степени это было заметно у пациентов со средней тяжестью заболевания, уровень экспрессии TRPM8 у которых был наибольшим. Вероятно, наблюдаемая реакция является адаптивной и может быть направлена на минимизацию дальнейшего холодового воздействия в случае, если оно будет носить продолжительный характер. Данная гипотеза косвенно подтверждается продемонстрированной ранее возможностью десенситизации TRPM8 под действием температурного стимула и химических агонистов [9], поскольку, как известно, десенситизация и снижение частоты транскрипции гена соответствующего рецептора в клетке часто являются взаимосвязанными процессами и следуют друг за другом в последовательности: десенситизация – интернализация – down-регуляция.
Основным результатом проведенной работы стала верификация повышенной экспрессии TRPM8 в назальном эпителии на уровне мРНК у больных БА с ХГДП. Назальный эпителий использовали для анализа ввиду его большей доступности, по сравнению с бронхиальным. Кроме этого, в развитии холод-индуцированного бронхоспазма и других симптомов наибольшее значение должны иметь рефлексогенные зоны верхних дыхательных путей, поскольку охлаждения нижних дыхательных путей, достаточного для активации TRPM8, как правило не происходит. Однако, основываясь на гипотезе единых дыхательных путей [8], с высокой степенью вероятности можно утверждать, что полученная оценка является универсальной, и также отражает состояние экспрессии TRPM8 в нижних отделах респираторного тракта. Не исключено, что увеличение экспрессии TRPM8 в дистальных бронхах также может иметь патогенетическое значение при БА, не связанное с ролью TRPM8 в холодовой рецепции. За последнее время было идентифицировано несколько эндогенных регуляторов этих катионных каналов, среди которых фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат, тестостерон, артемин и PIRT (фосфоинозитил взаимодействующий регулятор TRP) [6]. Поиск новых эндогенных лигандов TRPM8 и характеристика их биологической активности – ключевая проблема для понимания функциональной роли TRPM8 в организме человека; без ее решения эффективное и безопасное применение фармакологических агонистов и блокаторов рецептора также представляется невозможным.
1. Naumov D.E., Gassan D.A., Kilimichenko K.F., Afanas’eva E.Yu., Sheludko E.G., Kolosov V.P. Peculiarities of TRPM8 receptor expression in the respiratory tract of asthma patients. Bûlleten' fiziologii i patologii dyhaniâ 2018; 69:19-24 (in Russian). doi:https://doi.org/10.12737/article_5b96073c5711b1.83866044
2. Naumov D.E., Kotova O.O., Gassan D.A., Prokhodko A.G., Perelman J.M., Kolosov V.P. Role of TRPM8 gene polymorphisms in the formation of asthma phenotype with cold airway hyperresponsiveness. Bûlleten' fiziologii i patologii dyhaniâ 2017; 65:16-23 (in Russian). doi:https://doi.org/10.12737/article_59aca9cabd1528.72418133
3. Almagro P., Hernandez C., Martinez-Cambor P., Tresserras R., Escarrabill J. Seasonality, ambient temperatures and hospitalizations for acute exacerbation of COPD: a population-based study in a metropolitan area. Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dis. 2015; 10:899-908. doi:https://doi.org/10.2147/COPD.S75710.
4. Bodaghkhani E., Mahdavian M., MacLellan C., Farell A., Asghari S. Effects of meteorological factors on hospitalizations in adult patients with asthma: a systematic review. Can. Respir J. 2019; 2019:3435103. doi:https://doi.org/10.1155/2019/3435103
5. Fujita F., Uchida K., Takaishi M., Sokabe T., Tominaga M. Ambient temperature affects the temperature threshold for TRPM8 activation through interaction of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. J. Neurosci. 2013; 33(14):6154-6159. doi:https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.5672-12.2013
6. González-Muñiz R., Bonache M.A., Martín-Escura C., Gómez-Monterrey I. Recent Progress in TRPM8 Modulation: An Update. Int. J. Mol. Sci. 2019; 20(11):E2618. doi:https://doi.org/10.3390/ijms20112618
7. Li M., Li Q., Yang G., Kolosov V.P., Perelman J.M., Zhou X.D. Cold temperature induces mucin hypersecretion from normal human bronchial epithelial cells in vitro through a transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8)-mediated mechanism. J. Allergy Clin. Immunol. 2011; 128(3):626-634. doi:https://doi.org/10.1016/j.jaci.2011.04.032
8. Licari A., Castagnoli R., Denicolò C.F., Rossini L., Marseglia A., Marseglia G.L. The Nose and the Lung: United Airway Disease? Front. Pediatr. 2017; 5:44. doi:https://doi.org/10.3389/fped.2017.00044
9. McKemy D.D., Neuhausser W.M., Julius D. Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature 2002; 416(6876):52-58.
10. Qiu H., Yu I.T., Tse L.A., Chan E.Y., Wong T.W., Tian L. Greater temperature variation within a day associated with increased emergency hospital admissions for asthma. Sci. Total Environ. 2015; 505:508-513. doi:https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2014.10.003
11. Sabnis A.S., Reilly C.A., Veranth J.M., Yost G.S. Increased transcription of cytokine genes in human lung epithelial cells through activation of a TRPM8 variant by cold temperatures. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2008; 295(1):L194-200. doi:https://doi.org/10.1152/ajplung.00072.2008
12. Wang J., Yang G., Li M., Zhou X. Transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8)-based mechanisms underlie both the cold temperature-induced inflammatory reactions and the synergistic effect of cigarette smoke in human bronchial epithelial (16HBE) cells. Front. Physiol. 2019; 10:285. doi:https://doi.org/10.3389/fphys.2019.00285
13. Zhang Y., Peng L., Kan H., Xu J., Chen R., Liu Y., Wang W. Effects of meteorological factors on daily hospital admissions for asthma in adults: a time-series analysis. PLoS One 2014; 9(7):e102475. doi:https://doi.org/10.1371/journal.pone.0102475
