Izuchena chuvstvitel'nost' razlichnyh metodov opredeleniya fitotoksicheskoy aktivnosti pochvy i poch-vennyh mikromicetov. Metod pochvennoy vytyazhki nedostatochno chuvstvitelen, rekomendovano ispol'zovat' metod pochvennyh plastinok i metod iniciirovannogo mikrobnogo soobschestva (IMS). Izucheny 18 vidov test-rasteniy, kak pokazatel' fitotoksicheskoy aktivnosti dlya pochvy i pochvennyh mikromicetov predlozheno op-redelyat' ingibirovanie rosta kornya prorostka redisa. Metod IMS pozvolyaet vyyavit' rol' biogennogo faktora v razvitii pochvenogofitotoksikoza. Fitotoksicheskaya aktivnost' pochvy rekomendovana v kachestve parametra mikrobioindikacii pochvy v urboekosistemah na primere goroda Voronezha
fitotoksicheskaya aktivnost', metody opredeleniya, pochva, pochvennye mikromicety, mikrobioindikaciya
Фитотоксическая активность почвы широко используется в качестве одного из показателей ее биологической активности [1, 5, 7]. Под этим термином понимают способность почвы ингибировать рост и развитие растений в результате накопления токсических веществ. Абиогенные причины развития фитотоксикоза почвы могут определяться повышением содержания тяжелых металлов, нефтепродуктов, пестицидов и других поллютантов, а также значительным подкислением или защелачиванием. К биогенным факторам относятся микробные токсины, которые выделяются в почву определенными токсигенными видами микроскопическими грибами (микромицетами), бактериями и актиномицетами [8, 12, 13].
В литературе известны различные методы определения фитотоксической активности почвы, причем разные исследователи используют свои вариации и единицы оценки, что затрудняет сравнение результатов, полученных авторами.Элюатный метод предусматривает приготовление вытяжки из почвы, замачивание семян растений в этом растворе и наблюдение за процессом их прорастания; некоторые авторы используют прямой методоценки прироста побегов растений в почвенном экстракте;в вегетационных опытах применяют полив растений, выращенных на стерильном песке вытяжкой из почвы и наблюдение за приростом биомассы[3]. Отмечают, что этим методом можно оценить токсический эффект на растения только веществ, экстрагируемых из почвы водой.
Контактный метод определения фитотоксической активности почвы предусматривает непосредственный контакт тест-растений (как правило, используют семена растений) с почвенными пластинками [6]. В этом случае на всхожесть семян и рост проростков оказывают влияние как экстрагируемые водой, так и сорбированные почвенными частицами вещества. Новая модификация этого метода – метод инициированного микробного сообщества (ИМС) – позволяет оценить роль почвенного микробного сообщества в развитии фитотоксикоза почвы [2]. Для этого инициируют микробную сукцессию на поверхности почвенной пластинки путем напыления крахмала как широко используемого многими микроорганизмами трофического субстрата. Через определенное время инкубации в стерильных условиях при оптимальной влажности на поверхности почвенной пластинки формируется микробное сообщество, и семена тест-растений раскладываются на поверхность прямо на выросшие колонии микроорганизмов. Считается, что чем больше разница между показателями в опытах с почвенными пластинками и с ИМС, тем больше вклад биогенного фактора. Если разница небольшая, основной вклад играет накопление в почве поллютантов.
Также в работах разных авторов в качестве тест-растений используют травянистые однодольные (овес, пшеницу) или двудольные растения (кресс-салат и другие) или древесные растения (березу, тополь)[9-11].
Целью работы было изучение информативности различных методов определения фитотоксической активности почвы и выделенных нами ранее из почвы изолятов 8 видов микромицетов, а также поиск чувствительного тест-растения.
Объект исследования – почва пригородной зоны (залежь,чернозем выщелоченный) и почва различных городских зон г. Воронежа (рекреации –физически преобразованный чернозем, селитебная зона – урбанозем, транспортная зона на расстоянии 1 м от полотна дороги –интрузем). В каждом варианте опыта отбирали 5 почвенных проб, которые анализировали отдельно. Всего было выбрано 10 точек отбора проб: контроль (Рамонский район Воронежской области), рекреации (2 точки), селитебная зона (3 точки), транспортная зона (4 точки).
Исследованные изолятымикромицетов относятся к классу Deuteromycetesили несовершенные грибы и выделяются из чернозема выщелоченного в ранге типичных видов. Изоляты получены из коллекции чистых культур кафедры биологии растений и животных Воронежского государственного педагогического университета.Микромицеты выращивали на жидкой среде Чапека в течение 7 суток при 28оС. В фильтрате замачивали семена растений или выдерживали побеги в течение 1 суток (контроль – замачивание в воде), затем промывали водой и использовали для опытов.Семена проращивали в чашках Петри на увлажненной фильтровальной бумаге во влажной камере в течение 3 суток при 28оС, оценивали всхожесть семян и рост надземной и подземной части проростка. Побеги древесных растений выдерживали в почвенной вытяжке в течение 3 часов (контроль – в воде), определяли прирост побега через 2 суток инкубации в воде [3].
В качестве тест-растений использовали семена растений 7 семейств: Мятликовые (пшеница, кукуруза, овес), Мотыльковые (горох, люпин, вика), Маревые (сахарная свекла, марь белая), Сельдерейные (редька масличная, кресс-салат, редис), Амарантовые (амарант, щирица), Гвоздичные (звездчатка, гипсофила), Сложноцветные (василек, трехреберник), а также побеги березы.
Фитотоксическую активность почвы определяли элюатным методом: семена тест растений замачивали на сутки в 10%-ной почвенной вытяжке, промывали водой и проращивали аналогично описанному выше.
Контактный метод выполняли в двух модификациях. Метод почвенных пластинок: 100 г почвы увлажняли до 60% полной полевой влагоемкости,вносили в чашку Петри, выравнивали поверхность и раскладывали 50 мелких или 20 крупных семян. Через 3 суток выдержки при оценивали всхожесть семян и рост проростка.Контроль опыта – проращивание семян на увлажненной фильтровальной бумаге[6].
Метод ИМС. Формировали почвенную пластинку, затемее поверхность опудривалирастворимым крахмалом, что инициирует развитие микробной сукцессии и формирует амилолитическое микробное сообщество. Пластинку с крахмалом инкубировали при 28оС в стерильных условиях в течение двух недель, поддерживая постоянную влажность. Затем на поверхность выросших колоний микроорганизмов на почве раскладывали семена тест-растений. Через 3 суток снимали результат опыта[2].
Все опыты проведены в 5 биологических повторах.
Результаты и их обсуждение.
На изолятахмикромицетов нами была изучена чувствительность 18 тест-растений к токсическому действию микотоксинов (табл. 1). Наиболее чувствительнымик микотоксинам оказались семенаиз двудольных растений - редиса, из однодольных – озимой пшеницы.Часто используемый в работах кресс-салат обладал низкой чувствительностью.
Из тестируемых показателей наиболее чувствительным оказалось ингибирование роста корня проростка, хотя у одного вида грибов - Fusariumsolani– сильнее проявлялось влияние на всхожесть семян. Этот, вероятно, связано тем, что данный вид является фитопатогеном и входит ккомплекс возбудителей корневой гнили. Достаточно хорошее соответствие в реакции на микотоксины почвенных грибов обнаружено и на древесных растениях.В дальнейшем как тест-объект использовали редис (сорт «Жара»).
Нами проведена сравнительная оценка чувствительности трех методов определения фитотоксической активности почвы, подверженной разным видам урбаногенной нагрузки (табл. 2, 3).
Всеми методами выявлена одинаковая тенденция в городских почвах Воронежа: - возрастание фитотоксической активности в ряду рекреации ˂ селитебные зоны ˂ транспортные зоны. Однако чувствительность методов заметно различалась.
При использовании метода элюатного тестирования различия с контролем (пригородная почва) обнаружено только в почве транспортной зоны, фитотоксическая активность была в 2,2-2,4 раза выше по показателям ингибирования всхожести семян и роста корня тест-растения.
При использовании контактного метода почвенных пластинок (рисунок) различия с контролем обнаружены уже для почвы рекреационных зон (фитотоксическая активность возрастала в 1,2-1,4 раза), в селитебных зонах рост составил до 1,5-3,5 раз, а в транспортных зонах – до 4,1-4,4 раз. Эти результаты хорошо соответствуют росту уровня загрязнения почвы в городских зонах Воронежа [4].
Наибольшую чувствительность продемонстрировал контактный метод с ИМС. Различия с контролем достигали в почве селитебной зоны города 2,6-4,3 раз, а в почве транспортной зоны 4,6-5,9 раз. Это указывает на важную роль почвенного микробного сообщества в развитии фитотоксикоза городских почв. Полученные нами ранее данные о ходе микробной сукцессии в почве г. Воронежа и преобладании токсигенных видов микромицетов[ ]хорошо соответствуют такому заключению.
В наиболее нарушенных и загрязненных почвах селитебный и транспортной зон средние показатели фитотоксической активности заметно сдвинуты в сторону максимальных значений, что указывает на возрастание микромозаичности почвы в этих городских зонах.
Из тестируемых показателей наиболее информативным оказался рост корня проростка тест-растения, выраженный в процентах ингибирования по сравнению с контролем опыта. Различия с контрольной почвой по этому показателю выражены сильнее, чем по показателю всхожести семян. Это свидетельствует о том, что зародышевый корень прорывает оболочку семени, в основном, за счет питательных веществ семядолей, а токсины, ингибирующие рост корня, в наибольшей степени сорбируются семенной кожурой.
Заключение.
Таким образом, в качестве наиболее чувствительного метода для определения фитотоксической активности почвы рекомендовано использовать контактный метод почвенных пластинок. По разнице результатов, полученных этим методом и методом ИМС можно установить вклад биогенного фактора в фитотоксикоз почвы, однако последний метод требует заметно большего времени.
В качестве тест-растенияболее удобны двудольные растения, а именно редис (сорт Жара), т.к. более крупные семена пшеницы требуют большего количества повторов опыта.
Из ростовых показателей наиболее информативным является расчет ингибирования роста корня проростка.
Для оценки микромозаичности почвы необходимо в каждой точке отбора анализировать не средний образец, составленный из нескольких проб, а каждую пробу отдельно, и сравнивать средний показательфитотоксической активности с диапазоном минимального – максимального значения.
В целом, фитотоксическая активность почвы может быть рекомендована в качестве параметра биоиндикации почвы в различных экосистемах.
Таблица 1
Фитотоксическая активность изолятовпочвенныхмикромицетов на разных тест-растениях,
% ингибирования.
|
Виды микромицетов |
Редис |
Пшеница |
Береза |
||||
|
всхожесть семян |
рост |
всхожесть семян |
рост |
прирост побега |
|||
|
корня |
гипокотиля |
корня |
колеоптиля |
||||
|
Penicilliumdaleae |
26 |
36 |
21 |
12 |
18 |
4 |
23 |
|
Penicilliumrubrum |
53 |
100 |
33 |
47 |
74 |
28 |
98 |
|
Penicilliumfuniculosum |
48 |
85 |
62 |
20 |
42 |
46 |
77 |
|
Aspergillusustus |
22 |
34 |
24 |
13 |
8 |
5 |
27 |
|
Aspergillusclavatus |
100 |
100 |
61 |
76 |
68 |
60 |
75 |
|
Fusariumsolani |
77 |
36 |
15 |
79 |
18 |
12 |
31 |
|
Gliocladiumvirens |
17 |
46 |
18 |
12 |
18 |
13 |
5 |
|
Rhizopusstolonifer |
14 |
24 |
7 |
5 |
10 |
2 |
3 |
Таблица 2
Фитотоксическая активность почвы разных зон г. Воронежа по показателю всхожести семян редиса.
|
Ингибирование, % |
Контроль |
Городские зоны |
||
|
рекреации |
селитебные |
транспортные |
||
|
Почвенная вытяжка |
||||
|
min-max средн. |
3-6 4,3 |
2-7 4,7 |
4-5 4,7 |
5-10 9,3 |
|
max превышение контроля |
- |
1,1 |
1,1 |
2,2 |
|
Почвенные пластинки |
||||
|
min-max средн. |
2-4 2,7 |
3-4 3,7 |
2-5 4,0 |
4-16 11,0 |
|
max превышение контроля |
- |
1,4 |
1,5 |
4,1 |
|
Почвенные пластинки с ИМС |
||||
|
min-max средн. |
3-5 3,7 |
4-7 5,3 |
8-11 9,7 |
7-19 17,0 |
|
max превышение контроля |
- |
1,4 |
2,6 |
4,6 |
Таблица 3.
Фитотоксическая активность почвы разных зон г. Воронежа по показателю роста корня проростка редиса.
|
Ингибирование, % |
Контроль |
Городские зоны |
||
|
рекреации |
селитебные |
транспортные |
||
|
Почвенная вытяжка |
||||
|
min-max средн. |
4-5 4,3 |
4-6 5,3 |
3-7 5,3 |
6-13 10,3 |
|
превышениеконтроля |
- |
1,2 |
1,2 |
2,4 |
|
Почвенные пластинки (нативная почва) |
||||
|
min-max средн. |
7-10 8,3 |
8-14 10,0 |
7-30 28,7 |
27-42 36,3 |
|
превышениеконтроля |
- |
1,2 |
3,5 |
4,4 |
|
Почвенные пластинки с ИМС |
||||
|
min-max средн. |
8-10 8,7 |
7-15 10,7 |
22-40 39,0 |
42-54 51,3 |
|
превышениеконтроля |
- |
1,3 |
4,3 |
5,9 |
Рисунок. Рост проростков тест-растенияна почвенной пластинке: К - контроль опыта,
1 - почва пригородной зоны, контроль, 9 – почва транспортной зоны г. Воронежа.
1. Zvyagincev D.G. Biologiya pochv [Tekst] / D.G. Zvyagincev, I.P. Bab'eva, G.M. Zenova - M.: Akademiya, 2005. - 445 s.
2. Metody pochvennoy mikrobiologii i biohimii [Tekst] / Pod red. D.G. Zvyaginceva - Moskva: MGU, 1991. 304 s.
3. Metody eksperimental'noy mikologii [Tekst] / Pod red. V.I. Bilay − Kiev: Naukova dumka, 1982. 552 s.
4. Nazarenko N.N. Mikrobiologicheskaya indikaciya pochv urbolandshaftov [Tekst]: monografiya / N.N. Nazarenko, I.D. Svistova - Voronezh: VGAU, 2013. - 135 s.
5. Stahurlova L.D. Biomonitoring chernozemov v razlichnyh ekosistemah [Tekst] / L.D. Stahurlova, I.D. Svistova // Doklady Rossiyskoy sel'skohozyaystvennoy akademii. 2011. № 6. S. 28-29.
6. Tepper E.Z. Praktikum po mikrobiologii [Tekst] / E.Z. Tepper, V.K. Shil'nikova, G.I. Pereverzeva-M.: Drofa, 246 s.
7. Ekologicheskiy monitoring [Tekst] / Pod red. T. Ya. Ashihminoy - Moskva: Akademicheskiy proekt, 2005. -416 s.
8. Ekologiya mikroorganizmov [Tekst] / Pod red. A.I. Netrusova - Moskva: Akademiya, 2007. 382 s.
9. Kent A.D. Microbial communities and their interactions in soil and rhizosphere ecosystems / A.D. Kent, E.W.Triplett // Annual Review of Microbiology. - 2002. - Vol. 56. - P. 211-236.
10. Patkowska E.Antagonistic activity of selected bacteria occurring in the soil after root chicory cultivation / E. Patkowska, M. Konopínski // Plant, Soil and Environ. - 2014. - Vol. 60. - № 7. P. 320-324.
11. Romanenko G.A. Plant - microbe interactions: fundamental and applied research in Russia / G.A. Roma-nenko // Biology of Plant - Microbe interactions. Proc. Int. Congr. S.-Peterburg - St. Paul. USA, 2003. - V. 4. - P. 19-23.
12. van der Heijden M.G.A. The unseen majority: soil microbes as drivers of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems / M.G.A. van der Heijden, D. Bardgett, N.M. van Straalen // Ecol. Lett. - 2008. Vol. 11. - № 3. - P. 296-310.
13. Zhang F. Biological processes in the rhizosphere: a frontier in the future of soil science. / F. Zhang // The Future of Soil Science. - Wageningen, 2006.R. 155-157.
