Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
Blagoveschensk, Blagoveshchensk, Russian Federation
Heterogeneity of respiratory tract inflammation determines the clinical course and control of mild asthma. The aim of the research was to study the relationship between clinical and functional parameters and the form of bronchial inflammation in patients with mild persistent asthma against the background of standard basic anti-inflammatory therapy. In 198 patients with mild asthma (the mean age was 41.5±0.7 years old) against the background of maintenance therapy with low doses of inhaled glucocorticosteroids (ICS at a dose ≤500 mcg/day by beclomethasone dipropionate), there were determined the level of asthma control according to the questionnaire Asthma Control Test (ACT), lung function, airway reaction to 3-minute isocapnic hyperventilation with cold (-20ºC) air; there was done the collection of induced sputum (IS). The content of cells in cytograms of IS was assessed. The activity of myeloperoxidase (MPO) (in pixels) was measured by cytochemical method in neutrophilic and eosinophilic granulocytes. Group 1 (n=43; 22%) included patients with the eosinophilic pattern of bronchial inflammation, group 2 (n=155; 78%) included patients with mixed pattern of inflammation. In group 2, unlike the patients of group 1, in the inflammatory profile of infiltrate against the background of high neutrophil content (34.6±1.1 and 10.8±0.5%, respectively; p=0.000001), there was found an increased level of eosinophils (17.0±1.1 vs. 21.2±1.8%, respectively; p=0.048), and there was revealed a higher intragranular deposition of MPO (85.8±3.5 vs. 77.0±3.2 pixels, respectively; p=0.057). The mixed type of inflammation with the dominant neutrophil component and the greatest activity of MPO was associated with more pronounced clinical symptoms of the disease and low level of asthma control (16.0±0.7 vs. 18.7±0.4 ACT points, respectively; p=0.004), lung function decrease (FEV1 was 89.4±1.4 vs. 97.9±2.2%, respectively; p=0.005) and degree of FEV1 drop in response to bronchial provocation by cold air (-10.1±1.1 vs. -3.4±1.1%, respectively; p=0.002), due to insufficient anti-inflammatory effect of the used controller therapy. A discriminant equation is proposed, which can serve as an additional criterion for the effectiveness of anti-inflammatory therapy.
asthma, bronchial inflammation patterns, anti-inflammatory therapy.
В настоящее время достигнуты очевидные успехи в диагностике и, главным образом, в лечении бронхиальной астмы (БА) – одного из наиболее распространённых среди взрослого населения заболеваний бронхо-лёгочной системы [1, 6, 15]. По данным доказательных исследований, расширены представления о гетерогенности природы и вариабельности течения БА, выделено несколько фенотипов, дифференцируемых по клиническим проявлениям болезни, ведущему триггеру и характеру воспаления дыхательных путей, и, как следствие, разработаны и представлены на рынке новые высокоэффективные и безопасные средства терапии [1, 6, 7, 15–17]. Предложенные рядом авторов программы и фармакологические модели позволяют у 40–75% пациентов достигнуть стабильного или, по меньшей мере, хорошего контроля над БА при низкой вероятности обострений болезни [10]. Вместе с тем, в условиях реальной клинической практики в общей лечебной сети около 60% больных БА не имеют адекватного контроля над симптомами астмы в ответ на предложенную стандартную терапию; потенциально предотвратимые факторы выявляются более чем в 60% изученных случаев смертей от астмы [13, 14]. Отмечается, что даже для пациентов с лёгкой интермиттирующей формой БА может быть характерно неконтролируемое течение и развитие тяжёлых обострений, вплоть до фатального исхода [11, 13, 14].
Терапевтические неудачи у значительной части больных БА обусловлены, помимо недостаточной комплаентности пациентов и социально-экономических причин, недооценкой врачом при выборе тактики лечения конкретного больного особенностей профиля воспаления бронхов. Клеточно-гуморальная характеристика и степень выраженности хронического воспаления в дыхательных путях определяются сложным взаимодействием генетических факторов и факторов внешней среды, что обусловливает в ряде случаев рефрактерность к проводимой терапии, моделирует инертность снижения клинических проявлений астмы, а также потенцирует возможность обострений не только при тяжелой трудно контролируемой БА, но и при лёгкой, хорошо контролируемой форме болезни [11]. Приводятся данные о возможной сопряжённости достижений высокой стабильности (низкой вариабельности) и контроля БА с минимизацией выраженности воспаления бронхов у пациентов с лёгким течением болезни [11].
Цитологический анализ мокроты больных БА дает представление о морфофункциональном статусе клеточных эффекторов воспаления слизистой оболочки крупных, средних и мелких бронхов – эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитов. Данные о количестве и ферментативной активности гранулоцитарных пулов а отношении миелопероксидазы (МПО) положены в основу выделения воспалительных паттернов у больных БА и ассоциаций различных паттернов с клиническими параметрами тяжелой трудно контролируемой астмы [3]. МПО является показателем интенсивности воспалительного повреждения тканей как катализатор образования высоко реакционноспособных гипогалогенитов – активных форм галогенов [2]. Вопросы, касающиеся воспаления бронхов у пациентов с лёгкой персистирующей БА, затронуты лишь в единичных исследованиях [11]. Необходимо более углублённое изучение у таких больных морфологической организации эффекторов воспаления – популяции гранулоцитов, составляющих базис структурных паттернов воспаления дыхательных путей, в аспекте влияния воспалительных фенотипов на формирование различных вариантов течения лёгкой формы астмы и достижения клинического контроля над заболеванием.
Цель настоящего исследования состояла в изучении взаимосвязи между клинико-функциональными параметрами и формой бронхиального воспаления у больных БА лёгкого персистирующего течения на фоне стандартной базисной терапии.
Материалы и методы исследования
Проведено обследование 198 больных в возрасте от 39 до 50 лет (средний возраст 41,5±0,7 лет), обоего пола (мужчин 87, женщин 111) с длительностью заболевания более 1 года и ранее установленным диагнозом лёгкой персистирующей БА, согласно критериям GINA [12].
Критериями включения пациентов в исследование были: мужской и женский пол, возраст ≥20 лет и ≤60 лет; показатель объёма форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1) более 80% от должного значения (установленный в рамках проведения спирометрии в течение 7 дней до включения в исследование); базовая поддерживающая терапия низкими дозами ингаляционного глюкокортикостероидного препарата (ИГКС в дозе ≤500 мкг/сутки по беклометазона дипропионату) в течение не менее 24 недель до момента проведения клинического осмотра, функционального тестирования и забора биологического материала.
Пациентам, включённым в исследование, выполнялось мониторирование клинических симптомов астмы; исследование функции внешнего дыхания с анализом кривой поток-объем форсированного выдоха по стандартной методике при спирометрическом исследовании на аппарате Easy on-PC (nddMedizintechnik AG, Швейцария) (ОФВ1, ОФВ1/ЖЕЛ, МОС25-75) с оценкой реакции дыхательных путей на введение β2-агониста (сальбутамол) [5]; оценкой реакции дыхательных путей на холодовой стимул (ΔОФВ1ИГХВ) при стандартной 3-минутной изокапнической гипервентиляции холодным (-20ºС) воздухом (ИГХВ) [5]; сбор и цитологическое исследование микропрепаратов индуцированной мокроты (ИМ) по общепринятой методике [9].
Цитохимическое исследование активности фермента МПО эозинофильных и нейтрофильных гранулярных лейкоцитов поводилось в мазках ИМ по методу Грэхема-Кнолля [8] с докраской после обработки бензидином и перекисью водорода водным раствором азура-2. Изображения микропрепаратов получали с помощью цифровой видеокамеры ДСМ 510 с системой захвата изображения. Для цифровой обработки изображений клеток использовали компьютерные программы Image Tool и Optika Vision Pro (Италия), Mac Biophotonics Image S (США). На основании полученных данных рассчитывался средний цитохимический коэффициент (СЦК) МПО (в пикселях).
Условия проведения функциональных исследований были соблюдены в соответствии с международными стандартами проведения спирометрического исследования, бронхолитическая терапия отменялась за 12 часов до предполагаемой процедуры.
Клиническое исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утверждёнными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266. Все пациенты были подробно информированы и подписывали информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с протоколом, одобренным локальным Комитетом по биомедицинской этике Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания (протокол №120/1 от 25.10.17).
Статистический анализ полученного материала проводился на основе стандартных методов вариационной статистики. Качественные переменные описаны абсолютными и относительными в процентах частотами. Для определения достоверности различий в выборках с нормальным распределением использовали непарный критерий Стьюдента (t), при отклонении распределения от нормального – непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Анализ распространённости признака в сравниваемых группах (частота альтернативного распределения) проводили по критерию χ² (К. Пирсона) для четырёхпольной таблицы. Значение полученного критерия χ2 сравнивали с граничными значениями 3,84 для 5%-й вероятности. С целью определения степени связи между двумя случайными величинами проводили корреляционный анализ по Пирсону, рассчитывали коэффициент корреляции (r). По данным дискриминантного анализа определяли дискриминантную функцию с вероятностью различий не менее 95%, строили дискриминантное уравнение. Для всех величин принимали во внимание уровень значимости р˂0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Для определения ассоциаций между параметрами клинических проявлений астмы и клеточным паттерном воспаления дыхательных путей, оцениваемым по количественному соотношению внутри популяции гранулоцитов, с учётом нижней границы допустимой нормы содержания в мокроте нейтрофилов, составляющей 16,5% [4], исследуемые больные БА были распределены в группы. В 1 группу (n=43) вошли пациенты с эозинофильным паттерном бронхиального воспаления (≥2% эозинофилов и ˂16,5% нейтрофилов в цитограммах ИМ), во 2 группу (n=155) – пациенты со смешанным паттерном воспаления (≥2% эозинофилов и ≥16,5% нейтрофилов). При том, что во 2 группе, по отношению к больным 1 группы, в воспалительном профиле инфильтрата бронхов существенно превалировало число нейтрофилов (34,6±1,1 и 10,8±0,5%, соответственно; р=0,000001), уровень эозинофилов был также достаточно высоким (17,0±1,1 и 21,2±1,8%; р=0,048), на фоне этого регистрировалось снижение числа макрофагов в мокроте (43,0±1,3 и 62,8±2,5%; р=0,000001). Обращает на себя внимание, что уже при лёгкой стадии заболевания превалирующим фенотипом бронхиального воспаления у астматиков был смешанный, который присутствовал в 78% случаев, тогда как доля больных с эозинофильным паттерном составила 22%. Вариант с уровнем эозинофилов ≤2% в исследуемой популяции больных с лёгкой формой БА не выявлен.
При исследовании активности МПО, содержащейся в цитоплазматических гранулах эозинофилов и нейтрофилов ИМ, у пациентов 2 группы по отношению к 1 группе было обнаружена тенденция к более выраженному внутригранулярному депонированию фермента (85,8±3,5 и 77,0±3,2 пикселей, соответственно; р=0,057). Поскольку уровень концентрации и активности МПО внутри и вне гранулоцитов, продуцирующих фермент в лизосомах, зависит от потребности в генерации активных форм галогенов, можно предположить, что нарастание пероксидазного резерва гранулоцитов больных смешанной БА было связано с ускорением экзоцитоза и утилизации фермента, накоплением продуктов деятельности МПО – агрессивных галогенсодержащих реагентов – в экстрацеллюлярном пространстве. Судя по тенденции к повышению СЦК МПО при смешанном типе воспаления, рост уровня пероксидазосодержащих гранул в клетках-эффекторах свидетельствовал об активизации свободнорадикального окисления, эскалации окислительно-восстановительного дисбаланса и воспаления в бронхах, инициируемых преимущественно нейтрофилами. По всей вероятности, именно за счёт высокого количества нейтрофилов реализовалась наибольшая провоспалительная активность пероксидазы. На ведущую роль содержания нейтрофилов в стимуляции активности МПО в эффекторных клетках указывала найденная во 2 группе корреляционная связь между количеством нейтрофилов и показателем СЦК МПО гранулоцитов ИМ пациентов (r=0,26; р=0,015).
Нами была проведена оценка клинических проявлений астмы: анализ частоты эпизодов затруднённого дыхания в дневное и ночное время, использование бронхолитиков короткого действия, особое внимание уделялось симптомам заболевания за последнюю неделю перед исследованием, также подсчитывалось количество обострений, связанных с болезнью за 6 месяцев. Как оказалось, больные БА, имевшие смешанный тип воспаления (2 группа), несмотря на получаемую базисную терапию ИГКС, чаще испытывали дыхательный дискомфорт и потребность в использовании препаратов неотложной помощи по сравнению с пациентами 1 группы, что непосредственно отражалось на результатах спирометрического исследования (табл.). Пациенты 2 группы имели более низкие значения параметров бронхиальной проходимости (ОФВ1 и МОС25-75) и существенно более значимый прирост ОФВ1 в ответ на пробу с β2-агонистом, они активнее реагировали на острую бронхопровокацию холодным воздухом. Частота встречаемости лиц с холодовой гиперреактивностью дыхательных путей во 2 группе была достоверно выше, по сравнению с 1 группой (51,4 и 28,6%, χ2=6,15; р˂0,05, соответственно). Согласно данным вопросника Asthma Control Test (АСТ), у большинства представителей 2 группы отмечался существенно более низкий уровень контроля над заболеванием и большее число обострений астмы.
Таблица
Сравнительная клинико-функциональная характеристика больных БА (М±m)
|
Показатели |
1 группа |
2 группа |
р |
|
|
Возраст, лет |
39,1±1,0 |
45,6±1,3 |
р=0,005 |
|
|
Количество симптомов астмы за последние 7 дней до проведения исследования |
2,3±0,2 |
3,1±0,3 |
р=0,047 |
|
|
Использование β2-агониста короткого действия за последние 7 дней (кол-во/сутки) |
1,8±0,3 |
2,6±0,4 |
р=0,06 |
|
|
Количество обострений за предшествующие 24 недели до проведения исследования |
1,2±0,1 |
1,3±0,2 |
|
|
|
АСТ, баллы |
18,7±0,4 |
16,0±0,7 |
р=0,004 |
|
|
ОФВ1, % долж. |
97,9±2,2 |
89,4±1,4 |
р=0,005 |
|
|
ОФВ1/ЖЕЛ, % |
75,7±1,1 |
71,9±0,7 |
р=0,009 |
|
|
МОС25-75, % долж. |
74,1±4, 5 |
62,0±2,1 |
р=0,01 |
|
|
DОФВ1Б, % |
7,2±1,4 |
11,5±1,4 |
р=0,042 |
|
|
DОФВ1 ИГХВ, % |
-3,4±1,1 |
-10,1±1,1 |
р=0,002 |
Примечание: р – достоверность различий показателя между группами; ИГХВ – изменение показателя в ответ на пробу ИГХВ; Б – изменение показателя в ответ на введение β2-агониста.
Утверждение об интенсификации воспаления у больных со смешанным паттерном по сравнению с пациентами, в воспалительном паттерне которых превалируют эозинофилы, об усугублении клинических проявлений лёгкой БА за счёт увеличения числа и пероксидазной активности нейтрофилов, служит основанием для рассмотрения морфофункциональных показателей популяции гранулоцитов в качестве предикторов течения, а также терапии болезни. В обзоре мировых исследований, посвящённых морфологическому фенотипированию астмы и диагностическому значению фенотипов [7], изложены мнения о наибольшей частоте встречаемости нейтрофильного фенотипа воспаления во время обострения БА, тогда как в период ремиссии преобладает эозинофильный воспалительный фенотип, сопровождающий хороший ответ пациентов на лечение ИГКС и анти IL-5 препаратами. В процессе противовоспалительной терапии отмечены очевидные сдвиги в клеточном составе мокроты пациентов, происходящие за счёт изменений содержания эозинофилов при стабильных количественных показателях пула нейтрофилов [4]. Следовательно, в противоположность сегменту нейтрофилов, приведённые данные позволяют интерпретировать параметры эозинофильного звена воспалительного профиля бронхов как возможного прогностического маркера успешности применения базисной противовоспалительной терапии.
Опираясь на представленное выше мнение, из обеих групп обследуемых выделены больные, достигшие контроля над астмой (≥20 баллов), согласно результатам опроса пациентов по АСТ (22,9±0,5 и 22,2±0,3 баллов, соответственно) и лица показавшие плохой контроль над БА (16,3±0,6 и 13,2±0,3 баллов; р=0,004). Оказалось, что у пациентов, успешно контролировавших астму, процент содержания эозинофилов в мокроте был достоверно ниже, чем в группах больных с отсутствием контроля заболевания (рис. 1). Мы обратили внимание, что в группе больных со смешанным воспалительным паттерном, даже при контролируемом течении показатели бронхиальной проходимости были значимо ниже, чем у лиц с эозинофильным типом мокроты, с достоверными различиями на уровне мелких дыхательных путей (МОС25-75). Кроме того, этих больные активнее реагировали на пробу с β2-агонистом, а также кратковременную ингаляцию холодного воздуха при бронхопровокации (рис. 2). Как показал корреляционный анализ, у лиц с высоким содержанием нейтрофилов в мокроте, увеличение числа эозинофилов значимо влияло на проходимость дыхательных путей: ОФВ1 и МОС25-75 (r=-0,32; р=0,034; r=-0,34; р=0,032), величину реакции бронхов (DОФВ1Б) после ингаляции бронхолитика (r=0,41; р=0,006) и потерей контроля (АСТ) над БА (r=-0,17; р=0,022).
Рис. 1. Эозинофилы мокроты и бронхиальная проходимость у больных с контролируемым и неконтролируемым течением БА.
Рис. 2. Изменение ОФВ1 у больных с контролируемым и неконтролируемым течением БА после пробы с β2-агонистом и пробы ИГХВ.
В результате проведенного дискриминантного анализа, нами было построено дискриминантное уравнение, использование которого в реальной клинической практике может служить в качестве способа прогнозирования достижения уровня контроля лёгкой формы БА и позволит выбрать фенотип-ориентированный фармакотерапевтический режим ведения пациентов с эозинофильным паттерном воспаления дыхательных путей:
Д=1,38×Эозинофилы (%),
где Д – дискриминантная функция, граничное значение которой составляет 20,1. Превышение граничного значения свидетельствует о высокой вероятности отсутствия контроля и неэффективности назначенной базисной терапии. Вероятность различий выборок составила 97,86%, вероятность правильной классификации – 65,2%.
Таким образом, в общей популяции больных лёгким персистирующим течением БА воспаление слизистой оболочки дыхательных путей представлено двумя клеточными паттернами: эозинофильным (в 22% случаев) и смешанным (в 78% случаев). Смешанный, с доминирующим нейтрофильным пулом гранулоцитов, тип бронхиального воспаления у больных БА ассоциируется с более низким уровнем контроля заболевания, большей степенью реакции бронхов на провокацию холодным воздухом, по сравнению с эозинофильным фенотипом, что обусловлено недостаточным протективным противовоспалительным эффектом предложенного режима базисной терапии. Предложенное нами дискриминантное уравнение, построенное на основе оценки клеточного профиля ИМ, может служить в качестве дополнительного критерия эффективности базисной противовоспалительной терапии.
1. Nenasheva N.M. Phenotypes of bronchial asthma and choice of therapy. Prakticheskaya pul'monologiya 2014; 2:2-11 (in Russian).
2. Panasenko O.M., Sergienko V.I. Halogenizing stress and its biomarkers. Vestnik Rossijskoy Akademii Meditsinskikh Nauk 2010; (1):27-39 (in Russian).
3. Pirogov A.B., Kolosov V.P., Perel'man Y.M., Prikhod'ko A.G., Zinov'ev S.V., Gassan D.A., Mal'tseva T.A. Airway inflammation patterns and clinical and functional features in patients with severe uncontrolled asthma and cold-induced airway hyperresponsiveness. Russian Pulmonology 2016; 26(6):701-707 (in Russian). doi:https://doi.org/10.18093/086901892016266701707
4. Pirogov A.B., Prikhodko A.G., Perelman J.M., Zinov'ev S.V. Influence of neutrophilic component of bronchial inflammation on the level of disease control and lung function in patients with asthma. Bûlleten' fiziologii i patologii dyhaniâ 2016; 61:16-24 (in Russian). doihttps://doi.org/10.12737/21434
5. Prikhodko A.G., Perelman J.M., Kolosov V.P. Airway Hyperreactivity. Vladivostok: Dal’nauka; 2011 (in Russian).
6. Fedoseev G.B., Trofimov V.I., Petrova M.A. Many-faced bronchial asthma. Diagnosis, treatment and prevention. St. Petersburg: Nordmedizdat; 2011 (in Russian).
7. Fedoseev G.B., Trofimov V.I., Shaporova N.L., Aleksandrin V.A., Filippova N.A., Kryakunov K.N. Searching the truth: what is bronchial asthma? Russian Pulmonology. 2015; 25(1):5-18 (in Russian). https://doi.org/10.18093/0869-0189-2015-25-1-5-18
8. Hayhoe F.G.J., Quaglino D. Haematological cytochemistry. Moscow: Meditsina; 1983 (in Russian).
9. Bakakos P., Schleich F., Alchanatis M., Louis R. Induced sputum in asthma: From bench to bedside. Curr. Med. Chem. 2011; 18(10):1415-1422. doihttps://doi.org/10.2174/092986711795328337
10. Bateman E.D., Reddel H.K., Eriksson G., Peterson S., Ostlund O., Sears M.R., Jenkins C., Humbert M., Buhl R., Harrison T.W., Quirce S., O'Byrne P.M. Overall asthma control: the relationship between current control and future risk J. Allergy Clin. Immunol. 2010; 125(3):600-608. doihttps://doi.org/10.1016/j.jaci.2009.11.033
11. Dusser D., Montani D., Chanez P., de Blic J., Delacourt C., Deschildre A., Devillier P., Didier A., Leroyer C., Marguet C., Martinat Y., Piquet J., Raherison C., Serrier P., Tillie-Leblond I., Tonnel A.B., Tunon de Lara M., Humbert M. Mild asthma: an expert review on epidemiology, clinical characteristics and treatment recommendations. Allergy. 2007; 62(6):591-604. doihttps://doi.org/10.1111/j.1398-9995.2007.01394.x
12. Global Initiative for Asthma (GINA). Global strategy for asthma management and prevention (Updated 2017). Available at: http://www.ginasthma.com.
13. Levy M., Andrews R., Buckingham R., Evans H., Francis C., Houston R., Lowe D., Nasser S., Paton J., Puri N., Stewart K., Thomas M. Why asthma still kills: The national review of asthma deaths (NRAD). Project Report. Royal College of Physcians, London-Royal College of Physicians. 2014. Available at: http://eprints.uwe.ac.uk/23453/1/why-asthma-still-kills-full-report.pdf
14. Levy M. L. Asthma still kills: little change over five decades. NPJ Prim. Care Respir. Med. 2014; 24:14029. doi:https://doi.org/10.1038/npjpcrm.2014.29
15. Lockey R.F. Asthma phenotypes: an approach to the diagnosis and treatment of asthma. J. Allergy Clin. Immunol. Pract. 2014; 2(6):682-685. doihttps://doi.org/10.1016/j.jaip.2014.09.008
16. Papi A., Canonica G.W., Maestrelli P., Paggiaro P., Olivieri D., Pozzi E., Crimi N., Vignola A.M., Morelli P., Nicolini G., Fabbri L.M. Rescue use of beclomethasone and albuterol in a single inhaler for mild asthma. N. Engl. J. Med. 2007; 356(20):2040-2052. doihttps://doi.org/10.1056/nejmoa063861
17. Ortega H.G., Yancey S.W., Mayer B., Gunsoy N.B., Keene O.N., Bleecker E.R., Brightling C.E., Pavord I.D. Severe eosinophilic asthma treated with mepolizumab stratified by baseline eosinophil thresholds: a secondary analysis of the DREAM and MENSA studies. Lancet Respir. Med. 2016; 4(7):549-556. doihttps://doi.org/10.1016/s2213-2600(16)30031-5
