Kostanay, Kazakhstan
GRNTI 68.39 Животноводство
OKSO 35.06.01 Сельское хозяйство
TBK 562 Животноводство. Ветеринария
The aim of the research was to establish the genotype asssociation of the polymorphisms bPit-1-HinfI, bGH-AluI and bGHR-SspI with the beef productivity of Kazakh white-headed cattle. The material of the studies was the blood of farm animals. Blood samples and boning data were provided by LP «Zhanabek» and LP «Karaman-K», Kostanay region. The animal genotypes were determined by polymerase chain re-action-restriction fragment length polymorphism. Statistical processing of the results of genotyping and zoo-technical data was carried out using the programs Statistica 6.0 and Microsoft Excel. Evaluation of geno-types with meat productivity was carried out according to the live weight index, and indices characterizing the physique of animals were also analyzed. The results of the studies showed that the genotype bPit-1-HinFIAA of the pituitary transcription factor-1 gene was positively associated with the stretch sign at the age of 24 months. Thus, the index of the stretch index in cows with the genotype bPit-1-HinFIAA is 132.768 (126.667; 137.500), while this indicator for cows with genotypes bPit-1-HinFIAB and bPit-1-HinFIBB is 127.966 (120.833; 137.705 ) and 119.643 (117.544; 124.074) The polymorphism bIGF-1-SnaBI is associ-ated with the sign of live weight at the age of 12, 18, 24 months (the highest value is the genotype bIGF-1-SnaBIAB and bIGF-1-SnaBIAA, the smallest is the genotype bIGF-1-SnaBIBB). Thus, the genotype bPit-1-HinFIAA can be recommended as a genetic marker for the increased meat productivity of cattle of Kazakh white-headed breed. The genotype bIGF-1-SnaBIBB is a marker of reduced meat productivity of cattle. Working with polymorphism bIGF-1-SnaBI, as with a genetic marker, should not be based on selection on a preferred genotype, but on elimination of the negative genotype bIGF-1-SnaBIBB
genes, polymorphism, marker, cascade, productivity, breed, somatotropic, beef
Оценка животных по генетическим маркерам является более эффективной, если включены гены одного физиологического пути, так как в таком случае экспрессия одного гена влияет на экспрессию всех остальных. Следовательно, при анализе комплексного влияния полиморфизмов на исследуемые признаки обнаруживаются парные сочетания с потенцирующим действием [1].
Большой интерес для повышения мясной продуктивности крупного рогатого скота представляют гены соматотропинового каскада, белковые продукты которых являются ключевыми звеньями одной гуморальной цепи, участвующей как в процессе лактации, так и в процессах роста и развития млекопитающих (bPit-1, bGH, bGHR, bIGF-1) [2, 3]. Следовательно, изучение полиморфизмов этих генов является перспективным с точки зрения поиска маркеров, ассоциированных с признаками и молочной, и мясной продуктивности у крупного рогатого скота [4, 5]. Характеристика соматотропинового каскада. Известно, что гормон роста и целый ряд других белков (прямо или косвенно необходимых для его функционирования) обеспечивают разнообразные молекулярные и клеточные эффекты, приводящие, в конечном счёте, к развитию и росту организма [6]. Эти белки составляют своеобразную ось («axis») или систему, которая запускает и контролирует совокупность метаболических процессов, ведущих к росту и связанных с клеточной дифференцировкой [2].
Функционирование системы гормона роста представляется в виде целого ряда последовательных молекулярных процессов, в которых принимают участие десятки других белков/пептидов. Компоненты этой системы участвуют в запуске секреции гормона роста, его транспорте в кровотоке, в передаче гормонального сигнала в клетке-мишени (внутриклеточный сигналинг) и, наконец, в целенаправленных изменениях генной экспрессии в клетках-мишенях [6]. В целом, в системе гормона роста выделяют две ветви – «основную» и «боковую» или «дополнительную», а также три специальных регуляторных звена, обусловленных действием: соматолиберина (гипоталамический релизинг-фактор гормона роста или соматокрин, GHRH); соматостатина (SST, SRIF); грелина («ghrelin», GHRL). Каждое из этих регуляторных звеньев представляет собой целую цепь молекулярных событий, влияющих на секрецию гормона роста. Центральной фигурой в системе ГР/ИФР, естественно, считают сам гормон роста, который продуцируют высокодифференцированные соматотрофные клетки гипофиза. Синтез ГР обеспечивает ген bGH. Регуляция синтеза гормона роста представляет собой многоуровневый каскад взаимодействий белок – рецептор, тесно связанных между собой. Нарушение, и, тем более, выпадение любого звена влечет за собой изменения в работе соматотропиновой оси, которые могут привести как к различиям в фенотипических проявлениях количественных признаков продуктивности у сельскохозяйственных животных, так и к заболеваниям, развивающимся на разных этапах онтогенеза [7].
Цель исследований – установление ассоциации генотипов полиморфизмов bPit-1-HinfI, bGH-AluI и bGHR-SspI с мясной продуктивностью казахского белоголового скота, перспективных в использовании в качестве генетических маркеров хозяйственно-полезных признаков крупного рогатого скота.
Задачи исследований:
- провести генотипирование крупного рогатого скота по генам соматотропного каскада;
- изучить влияние генотипов исследуемых генов на показатели мясной продуктивности коров.
Материалы и методы исследований. Объект исследования – выборки коров казахской белоголовой породы. Предмет исследования – полиморфные гены соматотропинового каскада (bPit-1, bGH, bGHR и bIGF-1). Материал исследования – образцы ДНК, выделенной из крови коров казахской белоголовой породы.
Определение генотипов животных осуществлялось методом ПЦР-ПДРФ. Последовательности праймеров и условия ПЦР для анализа каждого полиморфизма приведены в таблице 1.
Таблица 1
Индивидуальные характеристики условий ПЦР
для исследуемых полиморфных локусов генов соматотропинового каскада
|
Полиморфизм |
Условия амплификации |
Последовательности праймеров |
|
bPit-1-HinfI |
95° – 5 мин; (95° С – 45 c; 55,3°С – 45 c; 72°С – 45 c) х |
HinFI-F: 5′-aaaccatcatctcccttctt-3′ |
|
HinFI-R: 5′-aatgtacaatgtcttctgag-3′ |
||
|
bGH-AluI |
95°С – 5 мин; (95°С – 30 c; 64°С – 30 c; 72°С – 60 c) х |
AluI-F: 5′-ccgtgtctatgagaagc-3′ |
|
AluI-R: 5′'-gttcttgagcagcgcgt-3′ |
||
|
bGHR-SspI |
95°С – 3 мин; (95°С – 30 c; 62°С – 30 c; 72°С – 30 c) х |
SspI-F: 5′-aatatgtagcagtgacaatat-3′ |
|
SspI-R: 5′-acgtttcactgggttgatga-3′ |
||
|
bIGF-1-SnaBI |
95°С – 3 мин; (95°С – 30 c; 64°С – 30 c; 72°С – 30 c) х |
SnaBI-F: 5′-attcaaagctgcctgcccc-3′ |
|
SnaBI-R: 5′-acacgtatgaaaggaact-3′ |
Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов включал обработку амплификата сайт-специфической рестриктазой и последующее разделение полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза. Использовали маркер молекулярных масс O’RangeRulerTM 50 bpDNALadder (Thermo Fisher Scientific, Литва). Электрофорез проводили в 2% агарозном геле (SeaKem LE Agarose, Lonza, США).
Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bPit-1 в экзоне 6 проводился с помощью рестриктазы HinfI. Полиморфизм обусловлен A→G нуклеотидной заменой, не приводящей к изменению аминокислотной последовательности. Сайтом узнавания для рестриктазы HinfI является последовательность G↓ANTC. Разрезаемый в ходе ферментации фрагмент содержит нуклеотид А, соответствующий аллелю bPit-1-HinfIВ [8]. В случае присутствия G-нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bPit-1-HinfIA.
Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bGH в экзоне 5 проводился с помощью рестриктазы AluI. Полиморфизм обусловлен транзицией C→G, приводящей к замене аминокислоты лейцин на валин в последовательности аминокислот белка. Сайтом узнавания для рестриктазы AluI является последовательность АG↓CТ. Распознаваемый ферментом аллель содержит нуклеотид С и обозначен как bGH-AluIL. В случае присутствия G-нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bGH-AluIV.
Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bGHR в экзоне 8 проводился с помощью рестриктазы SspI. Рестриктаза SspI распознает Т→А транзицию в экзоне 8. Данная замена вызывает подстановку полярного, хотя и незаряженного, остатка тирозина вместо нейтрального фенилаланина в положении 279 белка. Сайтом узнавания для рестриктазы является последовательность ААТ↓АТТ. Разрезаемый ферментом амплификат содержит нуклеотид Т, соответствующий аллелю bGHR-SspIF. В случае присутствия A-нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bGHR-SspIY.
Полиморфизм нуклеотидной последовательности гена инсулиноподобного фактора роста-1 bIGF-1 в области Р1 промоторного региона идентифицирован как Т→С трансверсия. Эта замена распознается рестриктазой SnaBI. Разрезаемый ферментом амплификат содержит нуклеотид Т, соответствующий аллелю bIGF-1-SnaBIА. В случае присутствия С-нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bIGF-1-SnaBIВ [9].
Определение предпочтительного и нежелательного аллелей проводилась путем сравнения показателей живой массы у телок с разными генотипами при рождении, а также в возрасте 3, 6, 9, 12, 18 и 24 месяца. Также в возрастах 12, 18 и 24 месяца была исследована ассоциация генотипов с индексами телосложения, которые характеризуют мясную продуктивность животных: сбитость, костистость, растянутость и массивность, и репродуктивную функцию животных: шилозадость.
Статистическая обработка результатов исследования проведена с использованием стандартного пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft, Inс. 1994-2001), при этом использованы модули Basic Statistic/tables, Nonparametric Statistics. Сравнение выборок по распределению частот аллелей исследуемых генов, а также оценку соответствия фактического распределения генотипов теоретически ожидаемому по закону Харди-Вайнберга проводили с помощью критерия χ2. Различия во всех случаях рассматривались как статистически достоверные при уровне значимости Р <0,05.
Так как характер распределения анализируемых признаков в исследованных группах не имел приближенно нормального распределения, и число выявленных животных с редкими генотипами в некоторых случаях было меньше 20, то в дальнейшем вся обработка и интерпретация данных, а также предоставление результатов проводилась методами непараметрической статистики. Данные представлены в виде Ме (25%; 75%), где Ме – медиана (срединное значение) признака; 25% и 75% – интерквартильный размах признака, характеризующий разброс распределения признака.
Результаты исследований. Из данных, полученных в результате изучения характеристик продуктивности казахской белоголовой породы с разными генотипами полиморфизма bPit-1-HinFI (Ме (25%; 75%)) можно отметить, что как в основной, так и в контрольной группах нет достоверных различий между генотипами bPit-1-HinFIАА, bPit-1-HinFIАВ и bPit-1-HinFIВВ.
В качестве тенденции можно отметить, что, начиная с возраста 6 месяцев и в возрасте 9, и 18 месяцев группа животных с генотипом bPit-1-HinFIВВ характеризуется более высоким показателем живого веса по сравнению с группами с генотипами bPit-1-HinFIАВ и bPit-1-HinFIВВ. Однако, низкая частота встречаемости данного генотипа в выборке казахской белоголовой породы не позволяет оценить достоверность наблюдения.
По данным сравнительного анализа групп с генотипами bPit-1-HinFIАА, bPit-1-HinFIАВ и bPit-1-HinFIВВ по индексам телосложения можно отметить, что в основной группе наблюдается статистически значимое превышение показателя растянутости в возрасте 24 месяца у коров с генотипом bPit-1-HinFIАА по сравнению с животными с генотипами bPit-1-HinFIАВ и bPit-1-HinFIВВ.
Так индекс растянутости у коров с генотипом bPit-1-HinFIАА составляет 132,768 (126,667; 137,500), в то время, как данный показатель у коров с генотипами bPit-1-HinFIАВ и bPit-1-HinFIВВ составляет 127,966 (120,833; 137,705) и 119,643 (117,544; 124,074) соответственно. То есть генотипом с наименьшим значением индекса растянутости является гомозигота bPit-1-HinFIВВ.
Таким образом по признаку растянутости в возрасте 24 месяца генотип bPit-1-HinFIАА можно рассматривать как потенциальный генетический маркер.
По результатам оценки ассоциации генотипа с мясной продуктивностью по полиморфизму bGH-AluI можно отметить, что в основной группе животных начиная с возраста 9 месяцев группа коров с генотипом bGH-AluILL превышает по живому весу группу коров с генотипом bGH-AluILV. В возрасте 24 месяца этот показатель различается у групп статистически значимо, что делает возможным рассматривать генотип bGH-AluILL как предпочтительный, а генотип bGH-AluILV, как альтернативный. Группа коров с генотипом bGH-AluIVV составляла всего 5 животных, поэтому не была включена в обработку.
В контрольной группе наблюдается противоположная тенденция, однако небольшое число наблюдений не позволяет сделать однозначных выводов.
По результатам анализа индексов телосложения у групп коров с генотипами bGH-AluILL, bGH-AluILV и bGH-AluIVV можно отметить, что в основной группе прослеживается тенденция к снижению индекса шилозадости и повышению индекса массивности у коров с генотипом bGH-AluILL по сравнению с коровами с генотипом bGH-AluILV. Это характеризует данную группу как более мясную с улучшенной репродуктивной функцией.
Эти данные консолидированы с контрольной группой. Однако результаты статистической обработки не подтверждают значимости сделанных наблюдений.
Анализ данных характеристик продуктивности в основной и контрольной группах коров с разными генотипами полиморфизма bGHR-SspI казахской белоголовой породы (Ме, (25%; 75%)) показал, что в основной группе в пределах полиморфизма bGHR-SspI между животными с генотипами bGHR-SspIFF, bGHR-SspIFY и bGHR-SspIYY достоверных различий в показателях живого веса не наблюдается. Такая же картина отмечается и в контрольной группе. В виде тенденции можно отметить, что гомозиготы по редкому аллелю bGHR-SspIYY характеризуются сниженным весом по сравнению с гомозиготами по более распространенному аллелю bGHR-SspIFF.
Такая же тенденция прослеживается в контрольной группе. Однако, число животных в группах не позволяет провести оценку достоверности наблюдаемых различий.
По результатам характеристик продуктивности основной и контрольной групп по индексам телосложения можно добавить, что животные основной группы с генотипом bGHR-SspIYY характеризуются сниженным индексом костистости в возрасте 24 месяца, а также сниженным индексом растянутости и массивности в возрасте 18 и 24 месяца. Так же для этой группы животных наблюдается снижение индекса шилозадости в возрасте 12, 18 и 24 месяца по сравнению с коровами с генотипом bGHR-SspIFF и bGHR-SspIFY.
В контрольной группе у животных с генотипом bGHR-SspIYY индекс шилозадости также снижен по сравнению с коровами с генотипом bGHR-SspIFY и bGHR-SspIFF.
По результатам оценки мясной продуктивности в группах коров с генотипами bIGF-1-SnaBIAA, bIGF-1-SnaBIAB и bIGF-1-SnaBIBB по полиморфизму SnaBI гена инсулиноподобного фактора роста 1 демонстрируются статистически значимые различия по признаку живой массы в возрасте 12, 18 и 24 месяца между животными с генотипами bIGF-1-SnaBIAA, bIGF-1-SnaBIAB и bIGF-1-SnaBIBB. Предпочтительными генотипами по полиморфизму bIGF-1-SnaBI являются генотипы bIGF-1-SnaBIAA и bIGF-1-SnaBIAB. Генотип bIGF-1-SnaBIBB у коров казахской белоголовой породы является альтернативным и характеризуется сниженной живой массой коров в возрасте 12, 18 и 24 месяца.
По оценке индексов телосложения, можно отметить, что в основной группе животные с генотипом bIGF-1-SnaBIAA характеризуются более низкими значениями индексов растянутости и массивности в возрасте 18 и 24 месяца, что свидетельствует в пользу более низкой мясной продуктивности при одинаковой живой массе с другими группами. В то же время, эти животные характеризуются более низким индексом шилозадости, что в свою очередь является преимуществом для реализации репродуктивной функции у коров.
В контрольной группе четких тенденций не прослеживается, что объясняется маленьким количеством животных.
Заключение. Таким образом для коров казахской белоголовой породы установлено следующее:
- полиморфизм bPit-1-HinFI ассоциирован с признаком растянутости в возрасте 24 месяца (наибольшее значение признака – генотип bPit-1-HinFIAA);
- полиморфизм bIGF-1-SnaBI ассоциирован с признаком живой массы в возрасте 12, 18, 24 месяца (наибольшее значение – генотип bIGF-1-SnaBIAB и bIGF-1-SnaBIAА, наименьшее – генотип bIGF-1-SnaBIBB);
- генотипы с наибольшим значением признака рассматриваются как предпочтительные, потенциальные генетические маркеры, и для оценки целесообразности включения их в селекционные программы данные групп животных сравнивали с продуктивностью общей выборки, чтобы установить характер и степень ассоциации генотипа с признаком. Исключение составляет признак шилозадости. В этом случае повышение индекса сопровождается осложнениями при первом отеле. Предпочтительным в селекционных мероприятиях считается генотип с наименьшим значением признака
1. White, E. V. the Combined phenotypic effects of polymorphic variants of genes somatotrope-new cascade (bPit-1, bPRL, bGH, bGHR and bIGF-1) to the characteristics of milk production in cattle Holstein / E. V. White, M. E. Mikhailova, N. Batin V. // Molecular and applied genetics : scientific collection. Tr. - 2012. - Vol.13. - S. 36-43.
2. Mikhailova, M. E. Influence of polymorphic variants of genes of somatotropin cascade bGH, bghr and bIGF-1 on signs of dairy productivity in Holstein cattle / M. E. Mikhailova, E. V. Belaya // Reports of the national Academy of Sciences of Belarus. - 2011. - Vol. 55, No. 2. - P. 63-69.
3. Tyul'kin, S. V. Polymorphism of pituitary transcription factor sires of the Republic of Tatarstan / S. V. Tyul'kin, I. I. Khatypov, A. V. Muratov [and others] // scientific notes of KHAWM them. H. Uh... Bauman. - 2015. - No. 222 (2). - Pp. 218-220.
4. Hammami, H. Environmental sensitivity for milk yield in Luxembourg and Tunisian Holsteins by herd management level / H. Hammami, B. Rekik, C. Bastin [et al.] // Journal of Dairy Science. - 2009. - Vol. 92. - №9. - P. 4604-4612.
5. Szewczuk, M. Association of insulin-like growth factor I gene polymorphisms (IGF1/TasI and IGF1/SnaBI) with the growth and subsequent milk yield of Polish Holstein-Friesian heifers / M. Szewczuk, M. Bajurna, S. Zych, W. Kruszyński // Czech Journal of Animal Science. - 2013. - Vol. 58. -P. 401-411.
6. Phillips, J. A. III Inherited defects in growth hormone synthesis and action. The metabolic and molecu-lar basis of inherited disease / ed. by C. R. Scriver, A. L. Beaudet, W. S. Sly, D. Valle. - 7-th Edition // McGraw-Hill Health Professions Division. - 1995. - Vol. 2. - P. 3023-3044.
7. Ruprechter, G. Metabolic and endocrine profiles and reproductive parameters in dairy cows under grazing conditions: effect of polymorphisms in somatotropic axis genes / G. Ruprechter, M. Carriquiry, J. M. Ramos [et al.] // Acta Veterinaria Scandinavica. - 2011. - Vol. 53. - P. 35-44.
8. Lemay, D. G. The bovine lactation genome: insights into the evolution of mammalian milk / D. G. Lemay, D. J. Lynn, W. F. Martin // Genome Biology. - 2009. - Vol. 10. - № 4.
9. Keady, S. M. Effect of sire breed and genetic merit for carcass weight on the transcriptional regulation of the somatotropic axis in longissimus dorsi of crossbred steers / S. M. Keady, D. A. Kenny, M. G. Keane, S. M. Waters // Journal of Animal Science. - 2011. - Vol. 89. - P. 4007-4016
