Ufa, Ufa, Russian Federation
Ufa, Ufa, Russian Federation
The article presents the results of a study about polymorphism of casein (CSN2, CSN3) and serum (LALBA, BLG) protein genes and an assessment of their impact on milk productivity of black-and-white cows in the Republic of Bashkortostan. The experimental part of the work was carried out on a sample of 235 black-and-white cows in the second lactation in Kalinin Agricultural Company of Sterlitamak District in 2020-2023. The methodology of the study included molecular genetic analysis by PCR-RFLP followed by electrophoretic detection of restriction fragments in 7.5% polyacrylamide gel. As a result of genotyping, the dominant genotypes were identified: CSN2 A1A1 (71±0.03%), CSN3 AA (87±0.03%), LALBA AB (58±0.03%), LGB AA (58±0.02%). The homozygosity levels for the studied loci were established: CSN2 - 73%, CSN3 - 87%, LALBA - 56%, LGB - 60%. Genetic equilibrium analysis revealed statistically significant deviations from Hardy-Weinberg equilibrium at the LALBA (Selender coefficient +0.32, χ2=26.02) and LGB (Selender coefficient -0.25, χ2=13.48) loci. A comprehensive assessment of milk productivity revealed that the maximum milk yield of 5872.57±184.15 kg was typical for animals with CSN2 A2A2 genotype. In cows with CSN3 AB genotype, the milk yield was 5793.47±109.85 kg and the protein mass fraction was 3.29±0.04%. In cows with LALBA BB genotype, the milk yield was 5991.66±140.89 kg and the protein yield was 195.33±14.23 kg. In cows with LGB AA genotype, the maximum protein mass fraction of 3.30±0.04% was revealed. The obtained results indicate the need to develop innovative selection and genetic programs that take into account the identified genetic features of the population to optimize quantitative and qualitative indicators of milk productivity.
polymorphism, milk protein, beta-casein (CSN2), kappa-casein (CSN3), alpha-lactalbumin (LALBA), beta-lactoglobulin (BLG), black-and-white cattle, productivity
Введение. В современном животноводстве особое внимание уделяется исследованию молекулярно-генетических характеристик молочных белков, поскольку именно они определяют не только пищевую ценность, но и технологические свойства коровьего молока. Белковые соединения - это сложные молекулярные структуры, состоящие из α-аминокислот, соединенных пептидными связями. Содержание белков в молоке варьируется в пределах 2,8-4,2%, что делает его важнейшим источником полноценного белка в рационе человека [1].
Генетический контроль формирования белкового состава молока осуществляется через взаимодействие шести основных генов: CSN1S1, CSN1S2, CSN2, CSN3, LALBA и BLG. Их совокупное влияние определяет около 90% всего молочного белка. Примечательно, что эти гены передаются потомкам группами (кластерами), что создает уникальные возможности для селекционной работы с молочным скотом [2, 3].
Исследования последних лет показали, что аллельный полиморфизм генов молочных белков оказывает существенное влияние на продуктивные качества молока и технологические характеристики молока крупного рогатого скота. Так, у гомозиготных животных с АА-генотипом гена LGB отмечается более высокое содержание белка, что делает их перспективными для производства белковых продуктов. При этом гетерозиготные особи по содержанию белка практически не отличаются от АА-генотипа. Однако по содержанию жира картина обратная: максимальный показатель наблюдается у коров с ВВ-генотипом, что делает их более ценными для производства жиросодержащих молочных продуктов. Генотип LALBA также проявляет значительное влияние на состав молока. Животные с АА-генотипом демонстрируют повышенное содержание белка на 0,03% по сравнению с В-аллелем. При этом гетерозиготный АВ-генотип показывает оптимальное содержание жира и белка, что делает его наиболее универсальным для различных направлений молочной промышленности [4].
Полиморфизм гена каппа-казеина тесно связан с технологическими свойствами молока, включая способность к свёртыванию под воздействием сычужного фермента. Аллель В гена CSN3 особенно ценен для сыроделия, так как обеспечивает более высокое содержание белка и улучшает качество готовой продукции [5, 6].
При этом в популяциях молочных пород крупного рогатого скота, особенно в черно-пестрой и голштинской породах, наблюдается недостаточное количество особей с предпочтительным генотипом CSN3ВВ [7].
Молекулярно-генетические исследования показали, что аллель В гена CSN2 обладает комплексным положительным эффектом на технологические свойства молока. Он не только самостоятельно улучшает коагуляцию и плотность сгустка, но и усиливает действие аллеля В гена CSN3. В свою очередь, аллель А CSN2 обеспечивает высокую термостабильность молочного сырья, что особенно важно для производства термически обработанных продуктов [8, 9].
Внедрение инновационных подходов в селекции, основанных на понимании генетических особенностей животных, является важнейшим аспектом совершенствования молочного скотоводства. Это обусловлено стремлением к повышению как количественных, так и качественных показателей молочной продукции. Комплексный подход к изучению генетического потенциала молочного скота позволяет не только прогнозировать продуктивные качества, но и разрабатывать инновационные методы селекции [10, 11, 12].
Таким образом, комплексное изучение молекулярно-генетических особенностей молочных белков открывает новые перспективы для развития современного молочного животноводства. Интеграция генетических исследований в селекционную работу позволяет оптимизировать процессы разведения скота и повышать эффективность производства молочной продукции [13, 14, 15].
Целью исследования является определение частоты встречаемости отдельных вариантов генов молочных белков CSN2, CSN3, LALBA и BLG и их влияния на показатели удоя и содержание белка в молоке коров черно-пестрой породы, разводимой в условиях Республики Башкортостан.
Условия, материалы и методы. В период 2020-2023 годов было проведено исследование генетического потенциала коров черно-пестрой породы в хозяйстве ООО «АП им. Калинина» Стерлитамакского района Республики Башкортостан. Для этого была отобрана экспериментальная группа из 235 животных, находящихся на второй лактации.
Генетический анализ животных осуществлялся в современном научно-образовательном центре Башкирского ГАУ, специализирующемся на передовых технологиях и генотипировании. Выделение ДНК производилось методом клеточного лизиса, а определение генотипа по генам CSN2, CSN3, LALBA и BLG выполнялось с помощью ПЦР-ПДРФ анализа. Амплификация проводилась на приборе BIO RAD CFX96 Real-Time System с применением специально подобранных праймерных пар:
CSN2F: 5` – cct-tct-ttc-cag-gat-gaa-ctc-cag – 3`
CSN2R: 5` – gag-taa-gag-gag-gga-tgtttt-gtg-gga-ggc-tct – 3`
CSN3F: 5`- tag-cca-aat-ata-tcc-caa-ttc-agt-3`;
CSN3R: 5`- tta-tta-ata-agt-cca-tga-atc-ttg-3';
LALBAF: 5`- aag-agt-tgg-atg-gaa-tca-cct-3`;
LALBAR: 5`- ttc-aaa-ttg-ctg-gca-tca-agc-3`;
LGBF: 5`- tgt-gct-gga-cac-cga-cta-caa-aag-3`
LGBR: 5`- gct-ccc-ggt-ata-tga-cca-ccc-tct-3`
Полученные ампликоны участков генов CSN2, CSN3, LALBA, BLG расщепляли рестриктазами – Ddel, HindIII, MhI и HaeIII, соответственно.
Размеры рестрикционных фрагментов определяли электрофорезом в 7,5% ПААГ с маркером pUC/Msp1 (Сибэнзим). Анализ гелей проводили на системе Gel Doc XR (Image Lab 2.0 “DNA-analyser”) с окрашиванием бромистым этидием и УФ-визуализацией.
Размеры рестрикционных фрагментов составили:
CSN2: А1А1 – 121 пн; А1А2 – 121, 86, 45 пн; А2А2 – 86, 35 пн;
CSN3: АА – 530 пн; АВ – 530, 400, 130 пн; ВВ – 400, 130 пн;
LALBA: АА – 328, 102 пн; АВ – 328, 211,117,102 пн; ВВ – 211,117,102 пн;
LGB: АА – 149, 99 пн; АВ – 149, 99, 74 + 74 пн; ВВ – 99,74 + 74 пн.
Отбор и подготовку проб молока к анализу проводили согласно ГОСТ 13928-84. Оценка продуктивности коров проводилась с помощью автоматизированной системы «Селекс – молочный скот». Анализ качества молока осуществлялся в лаборатории АО «Башкирское» по племенной работе при помощи специализированного оборудования «Лактан 700М».
Изучение генетического состава популяции включало оценку его соответствия математической модели Харди-Вайнберга.
Ожидаемую гетерозиготность определяли по формуле:
Hе = 1-(p2+q2), (1)
где Hе – ожидаемая гетерозиготность, p и q – частота аллелей.
Для определения степени отклонения наблюдаемых частот генотипов от ожидаемых использовали критерий согласия Пирсона (χ2), значение которого рассчитывали по следующей формуле:
, (2)
где О и Е – наблюдаемые и теоретически ожидаемые количества генотипов определённого типа, k – число генотипических классов.
Для оценки избытка гетерозигот в изучаемой выборке животных использовали коэффициент Селендера:
D = ((Hо-Hе))/Hе, (3)
где Но – наблюдаемая гетерозиготность, Hе – ожидаемая гетерозиготность.
Уровень гомозиготности (Са) рассчитывали по формуле Робертсона:
Са = Ʃ(Pi)2, (4)
где Са – показатель гомозиготности, Pi – частота i-го аллеля локуса.
В работе представлены результаты статистической обработки экспериментальных данных, выполненной по классической методике Е.К. Меркурьевой (1970) с применением табличного процессора Microsoft Office Excel. Достоверность различий оценивалась с помощью критерия Стьюдента при следующих уровнях значимости: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001.
Результаты и обсуждение. Для оценки генетического разнообразия исследуемых групп животных были определены показатели наблюдаемой (Ho) и ожидаемой (He) гетерозиготности. Вычисления базировались на частотах аллелей и генотипов в полиморфных локусах согласно принципу Харди-Вайнберга (табл. 1).
Таблица 1 - Исследование генетического профиля стада коров по маркерным генам молочных белков: CSN2, CSN3, LALBA, BLG (n=235)
|
Ген |
Частота генотипа |
Частота аллелей |
He |
Ca |
D |
χ2 |
|||
|
CSN2 |
A1A1 |
A1A2 |
A2A2 |
A1 |
A2 |
0,27 |
0,73 |
-0,07 |
0,85 |
|
0,71± 0,03*** |
0,25± 0,02 |
0,04± 0,01 |
0,84 |
0,16 |
|||||
|
CSN3 |
AA |
AB |
BB |
A |
B |
0,13 |
0,87 |
+0,08 |
1,01 |
|
0,87± 0,03*** |
0,13± 0,04 |
- |
0,93 |
0,07 |
|||||
|
LALBA |
AA |
AB |
BB |
A |
B |
0,44 |
0,56 |
+0,32 |
26,02 |
|
0,03± 0,01 |
0,58± 0,03*** |
0,39± 0,02 |
0,32 |
0,68 |
|||||
|
LGB |
AA |
AB |
BB |
A |
B |
0,40 |
0,60 |
-0,25 |
13,48 |
|
0,58± 0,02*** |
0,30± 0,03 |
0,12± 0,02 |
0,73 |
0,27 |
|||||
Примечание: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Анализ генетического полиморфизма гена CSN2 выявил три генотипические группы в исследуемой выборке коров. Гомозиготный генотип А1А1 представлен у 71% животных, гетерозиготный А1А2 - у 25%, а генотип А2А2 - лишь у 4%. При этом аллель А1 гена CSN2 демонстрирует высокую частоту встречаемости (84%).
Изучение полиморфизма гена CSN3 позволило установить, что в популяции черно-пестрого скота с голштинской примесью присутствуют два генотипических варианта. Большинство животных (87%) имеют генотип АА, 13% демонстрируют генотип ВВ. При этом аллель А CSN3 встречается у 93% особей.
Следует отметить, что выборка коров находится в состоянии генетического равновесия по локусам CSN2 и CSN3. Это подтверждается тем, что значение критерия χ² оставалось в пределах нормы, а показатели наблюдаемой гетерозиготности совпадали с ожидаемыми. Редкое появление определенных генотипов не влияет на общее равновесие, так как связано с низкой частотой соответствующих аллелей.
Относительно частоты встречаемости отдельных вариантов гена LALBA обнаружено, что число гетерозиготных особей существенно превалирует над количеством гомозиготных АА и ВВ вариантов, а именно 3% особей являются носителями генотипа АА и 39% - генотипа ВВ. Отсюда, 68% всех изученных коров содержали в своем геноме аллель В гена LALBA.
Анализ генетической структуры стада по гену LALBA показал показатель ожидаемой гетерозиготности (He) несколько ниже значения наблюдаемой гетерозиготности. Исследование гетерозиготности по гену LALBA обнаружило нарушение генетического равновесия. Об этом говорит положительное значение коэффициента Селендера (D = +0,32), указывающее на избыточное количество гетерозигот. Достоверность отклонения подтверждается критерием хи-квадрат, который существенно превышает критическое значение (3,84 при 1 степени свободы).
По гену LGB в изучаемой выборке коров наблюдаются противоположные результаты. При значительном доминировании аллельного варианта А LGB (0,73) над вариантом В (0,27) отмечен значительный недостаток гетерозиготных животных, что подтверждается полученным отрицательным значением коэффициента Селендера (-0,25), что также говорит о нарушении генного равновесия по указанному гену в исследуемой выборке (χ2 = 13,48). При этом, 12% изученных коров являлись носителями желательного ВВ-генотипа.
В изученной выборке крупного рогатого скота выявлена высокая степень гомозиготности по исследуемым генам казеиновых белков CSN2 (73%) и CSN3 (87%). Уровень гомозиготности по генам сывороточных белков LALBA и LGB значительно ниже и достигает 56% и 60% соответственно. Данное явление может быть объяснено тем, что при селекции на желаемый признак при подборе родительских пар увеличивается родство животных, участвующих в скрещивании. Возникающее близкородственное скрещивание (инбридинг) приводит к тому, что в популяции повышается число гомозиготных особей.
Таким образом, исследуемая группа коров находится в генном равновесии по двум изученным генам, а именно, молочным белкам CSN2 и CSN3. Наиболее часто встречаемыми являются варианты CSN2A1A1 (71%), CSN3AA (87%), LALBAAB (58%) и LGBAA (58%).
Следующим этапом исследования являлось определение влияния полиморфизма изученных генов на показатели обильномолочности и белковомолочности животных (табл. 2).
Таблица 2 – Влияние генетического полиморфизма на показатели молочной продуктивности коров черно-пестрой породы
|
Ген |
Генотип |
Удой, кг |
МДБ, % |
Выход белка, кг |
|
CSN2 |
A1A1 |
5567,26±120,24 |
3,30±0,01 |
183,72±13,34 |
|
A1A2 |
5604,80±75,49 |
3,29±0,01 |
184,40±10,23 |
|
|
A2A2 |
5872,57±184,15 |
3,26±0,05 |
191,45±11,08 |
|
|
CSN3 |
AA |
5561,54±125,27 |
3,28±0,02 |
182,42±12,51 |
|
AB |
5793,47±109,85 |
3,29±0,04 |
190,61±14,39 |
|
|
LALBA |
AA |
5446,83±113,84 |
3,29±0,03 |
179,20±13,42 |
|
AB |
5590,26±83,61 |
3,30±0,02 |
184,48±11,67 |
|
|
BB |
5991,66±140,89** |
3,26±0,03 |
195,33±14,23 |
|
|
LGB |
AA |
5536,77±76,05 |
3,30±0,04 |
182,71±13,04 |
|
AB |
5744,69±141,12 |
3,28±0,02 |
188,43±12,82 |
|
|
BB |
5761,14±70,72* |
3,27±0,02 |
188,39±11,41 |
Примечание: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Исследования молочной продуктивности выявили, что наиболее высокий показатель удоя (5872,57 кг) и выход молочного белка характерен для коров с генотипом А2А2 по гену CSN2. При этом животные, имеющие в генотипе аллель A1 CSN2, демонстрируют превосходство по содержанию белка в молоке.
Наилучшие результаты по всем трем изучаемым показателям молочной продуктивности обнаружены у особей с CSN3 АВ-генотипом. В среднем от этой группы коров получено 5793,47 кг молока за 305 дней лактации с содержанием 3,30% белка. Выход молочного белка составил 190,61 кг.
Изучение взаимосвязи между полиморфизмом генов сывороточных белков и молочной продуктивностью показало, что коровы с гомозиготным ВВ-генотипом достигают максимальных показателей удоя: 5991,66 кг по LALBA (p≤0,01) и 5761,14 кг по LGB (p≤0,05). Превосходство по массовой доле белка (3,30%) демонстрируют особи с генотипами LALBAAB и LGBAA. Наибольший выход молочного белка характерен для генотипов LALBABB (195,33 кг) и LGBАВ (188,43 кг).
Выводы. Проведенное исследование показало высокую степень гомозиготности стада по белкам казеиновой группы. При этом, генное равновесие по изучаемым белкам не нарушено за счет низкой частоты встречаемости их отдельных аллельных вариантов. Дальнейший анализ показал положительное влияние гомозиготных генотипов гена молочного белка CSN2 на обильномолочность у А1А1-генотипа и на белковомолочность у А2А2-генотипа.
Сделать достоверный вывод о связи полиморфизма гена CSN3 с молочной продуктивностью животных не представляется возможным в связи с отсутствием в данной выборке коров с гомозиготным ВВ-генотипом. Лучшими продуктивными характеристиками обладают гетерозиготные особи.
Исследование генетического баланса выявило нарушение равновесия в стаде по изучаемым генам. Нарушение генетического равновесия в стаде проявляется в виде дисбаланса гетерозиготных особей: значительное превышение их числа по гену LALBA и существенный недостаток по гену LGB, что свидетельствует о выраженном селекционном давлении в стаде.
По генам сывороточных белков коровы показали неоднородные результаты молочной продуктивности. Выявлено, что аллель В положительно влияет на количество удоя и выход молочного белка, аллель А на содержание белка в молоке. В результате исследования обнаружено, что наилучшей продуктивностью обладают гетерозиготные животные.
1. Zobkova ZS, Fursova TP, Zenina DV. [The ratio of fat and protein in normalized milk as one of usefulness limitations of whole milk products]. Molochnaya promyshlennost. 2020; 1. 45-46 p. http:// doi.org/10.31515/1019-8946-2020-01-45-46. EDN FGVYZL.
2. Kuznetsov SB, Solodneva EV, Semina MT. [New combinations of alleles in the variants of the casein cluster genes of cattle and revision of their nomenclature]. Genetika. 2022; Vol.58. 8. 889-901 p. https://doi.org/10.31857/S0016675822080057. EDN DHEGKW.
3. Unzhakova A, Kochnev N, Goncharenko G. Association of k-casein, β-lactoglobulin, α-lactalbumin and leptin gene polymorphisms with bovine productivity traits in Western Siberia. E3S Web of Conferences: 14th International scientific and practical conference on state and prospects for the development of agribusiness, INTERAGROMASh 2021. Rostov-on-Don, 24-26 fevralya 2021 goda. Vol.273. Rostov-on-Don: EDP Sciences. 2021; http:// doi.org/10.1051/e3sconf/202127302021. EDN LUYCFD.
4. Paramonova MA, Valitov FR, Dolmatova IYu. [Effect of CSN3, ALA and LGB gene polymorphism of black-and-white cows on productivity and quality of acidophilus]. Vestnik Bashkirskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2021; 2(58). 44-51 p. https://doi.org/10.31563/1684-7628-2021-58-2-44-51. EDN YCPTJK.
5. Khudyakova NA, Kudrina MA, Stupina AO. [Genetic markers of dairy productivity in cattle (review)]. Effektivnoe zhivotnovodstvo. 2022; 6(181). 74-77 p. https://doi.org/10.24412/cl33489202267477. EDN QWFEAM. DOI: https://doi.org/10.24412/cl-33489-2022-6-74-77
6. Safina NYu, Gaynutdinova ER, Zinnatova FF. [The influence of complex genotypes of the kappa-casein (CSN3) and beta-lactoglobulin (LGB) genes on milk productivity of Holstein cattle]. Agrarnyy nauchnyy zhurnal. 2020; 5. 64-67 p. https://doi.org/10.28983/asj.y2020i5pp64-67. EDN PKUANV.
7. Kruchinin AG, Illarionova EE, Galstyan AG. Effect of CSN3 gene polymorphism on the formation of milk gels induced by physical, chemical, and biotechnological factors]. Foods. 2023; Vol.12. 9. 1767 p. https://doi.org/ 10.3390/ foods12091767. EDN QJNAFP. DOI: https://doi.org/10.3390/foods12091767
8. Kalashnikova LA, Trufanov VG, Khabibrakhmanova YaA. [Beta-casein gene polymorphism in Holstein cows]. Molochnoe i myasnoe skotovodstvo. 2021; 1. 19-21 p. https://doi.org/10.33943/MMS.2021.60.50.003. EDN KNDPCC.
9. Paramonova MA. [Influence of CSN2 milk protein gene polymorphism on the productive qualities of black-and-white cattle]. Izvestiya Orenburgskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2023; 5(103). 300-305 p. https://doi.org/10.37670/2073-0853-2023-103-5-300-305. EDN UWBTHV.
10. Kalashnikova LA, Ganchenkova TB, Ryzhova NV. Genetic assessment of Holstein cattle using microsatellite markers]. Russian Journal of Genetics. 2025; Vol.61. 1. 45-55 p. https://doi.org/10.1134/S1022795424701382. EDN FEDBQB.
11. Kalashnikova LA, Trufanov VG, Khabibrakhmanova YaA. [Polymorphism of beta-casein gene in Holstein cows]. Molochnoe i myasnoe skotovodstvo. 2021; 1. 19-21 p. https://doi.org/10.33943/MMS.2021.60.50.003. EDN KNDPCC.
12. Dunin IM, Dunin MI, Adzhibekov VK. [Breed and genetic-selection base of domestic animal husbandry]. Zootekhniya. 2021; 1. 2-6 p. https://doi.org/10.25708/ZT.2020.66.16.001. EDN XEMTDB.
13. Zinnatov FF, Yakupov TR, Zinnatova FF. [Polymorphic variants of protein metabolism genes in Holstein cows]. Vestnik Mariyskogo gosudarstvennogo universiteta. Seriya: Selskokhozyaystvennye nauki. Ekonomicheskie nauki. 2022; Vol.8. 1(29). 25-34 p. https://doi.org/10.30914/2411-9687-2022-8-1-25-34. EDN BGWCBX.
14. Zinnatov FF. [Use of DNA analysis in identification of polymorphic variants of lipid and protein metabolism genes in cows]. Voprosy normativno-pravovogo regulirovaniya v veterinarii. 2021; 1. 96-97 p. EDN SSKDTS.
15. Lemyakin AD, Badanina LS, Sabetova KD. [Realization of the genetic potential of black-and-white cows of various genotypes for the kappa-casein gene]. Agrarnaya nauka Evro-Severo-Vostoka. 2023; Vol.24. 6. 1021-1028 p. https://doi.org/10.30766/2072-9081.2023.24.6.1021-1028. EDN VVPTAV.
