Russian Federation
UDC 616-097
UDC 578.828.11
Enzootic leukemia is the most common infectious disease of cattle, which causes significant economic damage, posing a threat to the extinction of the gene pool of the main valuable highly productive breeds. One of the leading factors reducing the effectiveness of health measures against this infection is insufficient diagnostics. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a highly sensitive serological test. The International Epizootic Bureau recommends using ELISA as one of the main methods for diagnosing enzootic leukemia in cattle. Due to its high sensitivity, specificity, and the possibility of automating the reaction, ELISA has shown high efficiency in eliminating leukemia in disadvantaged farms. The ELISA mechanism involves the interaction of an antigen with antibodies specific to it. The “antigen-antibody” complex is detected using auxiliary reaction components, such as a conjugate of anti-species antibodies labeled with an enzyme and a substrate with a chromogen. However, when setting up ELISA, false-positive and false-negative results may occur, the reduction of which with a simultaneous improvement in the diagnostic characteristics of the analysis are relevant. The purpose of these studies was to improve the conditions for setting up ELISA for the detection of specific antibodies against the causative agent of bovine leukemia. It was found that an aqueous solution of 2% glutaraldehyde increases the sorption activity of the tablet, the optimal concentration of the viral antigen obtained from a chronically infected culture of sheep embryo kidney cells for sensitization of the tablet is 5 micrograms/ml, the blocking solution is 0.5% intact sheep serum. This serum also has a stabilizing effect on the conjugate and eliminates non-specific interaction of anti-species antibodies with antibodies of the analyzed samples. The use of the shaking parameter of the tablet in a thermoshaker increases the positivity coefficient of the positive serum and, therefore, the sensitivity of the analysis. The optimized version of the ELISA showed high specificity and sensitivity.
FLK BLV, leukemia virus, antigen, antibodies, intact sheep serum, enzyme immunoassay
Введение. Энзоотический лейкоз является одним из широко распространенных инфекционных заболеваний крупного рогатого скота в Российской Федерации [1]. Согласно официальным данным в России в 2023 году лейкоз крупного рогатого скота был зарегистрирован на территории 63 субъектов и зафиксировано 1584 новых неблагополучных пунктов [2]. В Республике Татарстан эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота оценивается как эндемичная [3].
Недостаточная диагностика является ведущим фактором низкой эффективности оздоровительных мероприятий в неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота хозяйствах [4]. Несмотря на внедрение в практику ветеринарных лаборатории современных методов диагностики лейкоза, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) [5], серологические методы занимают основное место в массовых диагностических исследованиях. Иммуноферментный анализ (ИФА) является высокочувствительным серологическим методом, который показал высокую эффективность при оздоровлении хозяйства от лейкоза крупного рогатого скота, когда возникает необходимость исследования большого количества образцов сывороток [6]. ИФА основан на индикации специфических антител в сыворотках крови животных, выявляемых при помощи антигенов вируса лейкоза крупного рогатого скота [7]. Основным средством получения антигенов gp51 и р24, используемыми в ИФА тест-системах для диагностики лейкоза скота является вирус, культивируемый в хронически инфицированной культуре клеток почек эмбриона овцы (FLK BLV) [8]. Однако несмотря на то, что метод ИФА широко применяется для эпизоотологического мониторинга лейкоза крупного рогатого скота и сконструированы различные варианты диагностических ИФА тест-систем, уменьшение ложноположительных и ложноотрицательных результатов анализа с параллельным улучшением диагностических параметров тест-системы, таких как чувствительность и специфичность имеют актуальность.
Целью данного исследования являлось усовершенствование условий постановки непрямого твердофазного ИФА для индикации специфических антител против вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Условия, материалы и методы. Антиген. В работе использовали антигенный материал вируса лейкоза крупного рогатого скота, полученный из FLK BLV и очищенный методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы [9].
Планшет. В качестве твердой фазы применяли стрипованные планшеты производства АО «Фирма Медполимер» (Россия).
Контрольные образцы. В качестве положительного контрольного образца (ПКО) и отрицательного контрольного образца (ОКО) использовали пробы сывороток крови крупного рогатого скота, которых исследовали коммерческими серологическими наборами и подтверждали наличие/отсутствие специфических антител против вируса лейкоза крупного рогатого скота. Также дополнительно от этих же животных отбирали кровь с целью установления наличия или отсутствия провирусной ДНК методом ПЦР [10].
Сыворотки. Для блокирования свободных центров связывания лунок планшета использовали интактную сыворотку овцы.
Концентрацию белка в овечьей сыворотке измеряли спектрофотометрическим методом с использованием для расчета эмпирической формулы Калькара.
Конъюгат антивидовых антител. В качестве конъюгата антивидовых антител был использован коммерческий препарат антивидовых антител кролика против иммуноглобулинов крупного рогатого скота, меченных ферментом пероксидазой, производства ООО «ИМТЭК» (Россия).
Непрямой вариант ИФА. Определение серологической активности полученного антигена в твердофазном непрямом ИФА осуществляли по общепринятой методике. Для повышения сорбционных свойств лунок планшета использовали глутаровый альдегид в виде 2% раствора на дистиллированной воде по 100 мкл на каждую лунку с инкубированием планшета 2 ч при температуре 37 ºС. После инкубации раствор глутарового альдегида сливали и планшет промывали один раз карбонатно-бикарбонатным буферным раствором (КББ), рН которого составил 9,5. После промывки осуществляли сенсибилизацию лунок планшета очищенным на градиенте плотности сахарозы антигеном в концентрациях от 1 до 20 мкг/мл. Антиген разводили на КББ (рН 9,5), объем раствора антигена для каждой лунки равнялся 100 мкл. Планшет с антигеном выдерживали при температуре от 2 °С до 8 °С в течение 16 ч. Далее раствор антигена сливали и планшет промывали один раз фосфатно-солевым буферным раствором ФСБ (рН-7,3) содержащим Твин-20 в концентрации 0,1% (ФСБ-Т). С целью блокировки свободных центров связывания лунок планшета использовали интактную сыворотку крови овцы, которую вносили по 100 мкл на каждую лунку и инкубировали планшет на термошейкере ELMI ST-3 (Латвия) в течение 2 ч при температуре 37 ºС и встряхиванием 300 об/мин. После инкубации раствор овечьей сыворотки сливали и планшет промывали один раз ФСБ-Т. Исследуемые сыворотки разводили на ФСБ-Т и планшет с сыворотками инкубировали на термошейкере в течение 45 мин при температуре 37 ºС и встряхиванием 600 об/мин. После чего сыворотки сливали и планшет промывали трехкратно ФСБ-Т. Для индикации образованных комплексов «антиген-антитело» использовали антивидовой конъюгат против иммуноглобулинов крупного рогатого скота. С целью стабилизации конъюгата его рабочее разведение (1:30000 согласно инструкции) разбавляли интактной сывороткой крови овцы в соотношении 1:10. Планшет с конъюгатом инкубировали в аналогичных для исследуемых сывороток крупного рогатого скота условиях. Далее раствор конъюгата сливали и планшет промывали пятикратно ФСБ-Т. Визуализацию образованных комплексов «антиген-антитело-антивидовое антитело» осуществляли добавлением в каждую лунку планшета по 100 мкл субстратного раствора с хромогенным компонентом тетраметилбензидином (ООО ИМТЭК, Россия) с выдерживанием планшета в течение 10 мин в темном месте. Для остановки реакции использовали 1М раствор серной кислоты. Оптическую плотность (ОП) исследуемых образцов определяли на спектрофотометре Multiskan Go Thermo Scientific (США) при длине волны 450 нм.
В качестве основного показателя, характеризующего позитивность анализируемой сыворотки крупного рогатого скота или наоборот, приняли коэффициент позитивности (Р) (отношение оптической плотности исследуемой сыворотки к оптической плотности отрицательного образца). Если коэффициент Р составил ≥ 2,2, то исследуемую сыворотку крупного рогатого скота приняли как положительную на содержание антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Образец интерпретировали как сомнительный, если Р варьировал от 2,0 до 2,2. В качестве отрицательного результата приняли значения коэффициента Р ≤ 2,0.
Результаты и обсуждение. С целью усовершенствования условий постановки непрямого варианта ИФА нами была проведена серия экспериментов по изучению влияния глутарового альдегида на сорбционные свойства планшета. Также определяли оптимальную концентрацию антигена вируса лейкоза для сенсибилизации планшета. Изучали блокирующие свойства интактной сыворотки крови овцы и влияние встряхивания планшета на чувствительность и специфичность ИФА
С целью повышения сорбции планшет инкубировали в течение 2 ч при 37 ºС 2% водным раствором глутарового альдегида. В данном исследовании глутаровый альдегид выполнял ключевую роль мостика для ковалентного соединения твердой фазы планшета и целевого белка вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Оптимальные параметры ИФА определяли методом титрования образцов ПКО и ОКО с разведения 1:25 до 1:3200. Для оценки эффективности сорбционной активности антигена определяли коэффициент позитивности (Р), который представляет собой отношение оптической плотности (ОП) ПКО к ОП ОКО (табл. 1).
Таблица 1 - Влияние глутарового альдегида да сорбционную активность планшета
|
Степень разведе- ния сыво-ротки |
Глутаровый альдегид |
Без глутарового альдегида |
||||
|
Оптическая плотность (М± SD) |
Р |
Оптическая плотность (М± SD) |
Р |
|||
|
ОКО |
ПКО |
ОКО |
ПКО |
|||
|
1:25 |
0,203±0,06 |
1,214±0,08 |
5,9 |
0,285±0,13 |
0,742±0,05 |
2,6 |
|
1:50 |
0,168±0,08 |
1,025±0,06 |
6,1 |
0,218±0,07 |
0,509±0,07 |
2,3 |
|
1:100 |
0,094±0,15 |
0,927±0,05 |
9,8 |
0,105±0,08 |
0,386±0,04 |
3,6 |
|
1:200 |
0,068±0,03 |
0,783±0,07 |
11,5 |
0,082±0,06 |
0,301±0,14 |
3,7 |
|
1:400 |
0,049±0,09 |
0,496±0,04 |
10,1 |
0,067±0,04 |
0,254±0,07 |
3,8 |
|
1:800 |
0,032±0,05 |
0,358±0,06 |
11,1 |
0,052±0,15 |
0,226±0,03 |
4,3 |
|
1:1600 |
0,024±0,07 |
0,227±0,04 |
9,4 |
0,036±0,09 |
0,171±0,05 |
4,7 |
|
1:3200 |
0,016±0,06 |
0,129±0,09 |
8,0 |
0,021±0,05 |
0,115±0,08 |
5,4 |
Из таблицы 1 видно, что 2% водный раствор глутарового альдегида повышает сорбционную активность планшета тем самым увеличивая коэффициент позитивности и в целом повышая чувствительность, а также специфичность ИФА.
Для определения оптимальной сенсибилизирующей концентрации антигена вируса лейкоза были использованы следующие его разведения: 1; 2,5; 5; 10 и 20 мкг/мл. Результаты ИФА показали, что наиболее оптимальная концентрация антигена составляет 5 мкг/мл, при которой оптическая плотность (ОП) ПКО составила 1,325, а ОКО – 0,280, а Р был равным 4,7 ед. Также следует отметить, что при концентрациях 2,5 и 1,0 мкг/мл антиген вируса лейкоза проявлял наиболее низкую серологическую активность, коэффициент отношения ОП отрицательного и контрольного образцов был равным 1,23 и 0,94 ед. соответственно.
По литературным данным известно, что в ИФА с целью блокирования свободных центров связывания лунок планшета для снижения неспецифических реакции используются такие белки как бычий сывороточный альбумин, желатин, казеин, а также сыворотка любого вида животного, обезжиренное сухое молоко [11]. Задачей следующего эксперимента было изучение блокирующей активности интактной овечьей сыворотки в 0,5, 1,0, 1,5 и 2,0 % концентрациях (по белку). Установили, что наиболее оптимальным в качестве блокирующего раствора является использование 0,5% интактной сыворотки овцы, при которой оптические показатели ОКО не превышали 0,104, а оптическая плотность ПКО равнялась 2,023, коэффициент Р – 19,4. Тогда как оптическая плотность ПКО без блокировки достигла 3,154, а ОКО – 1,76, коэффициент Р – 1,8 (табл. 2).
Таблица 2 – Подбор оптимальной концентрации интактной сыворотки овцы для блокирования остаточных центров связывания лунок планшета
|
Концентрация интактной сыворотки овцы (по белку), % |
Оптическая плотность |
Р |
Оптическая плотность (без блокирующего раствора) |
Р |
||
|
ПКО |
ОКО |
ПКО |
ОКО |
|||
|
0,5 |
2,023±0,08 |
0,104±0,03 |
19,4 |
3,154±0,76 |
1,76±0,56 |
1,8 |
|
1,0 |
1,814±0,05 |
0,099±0,07 |
18,3 |
|||
|
1,5 |
1,048±0,12 |
0,093±0,05 |
11,3 |
|||
|
2,0 |
0,968±0,07 |
0,086±0,09 |
11,2 |
|||
|
Примечание: Разведение сывороток – 1:25 |
||||||
С целью стабилизации конъюгата, рабочее разведение (1:30000) разбавляли интактной сывороткой крови овцы в соотношениях 1:1; 1:2; 1:4; 1:8 и 1:10. Для всех исследованных разведениях рабочего раствора конъюгата с интактной сывороткой овцы коэффициент позитивности составил выше 10, следовательно, данная сыворотка оказывает стабилизирующее действие на конъюгат и предотвращает неспецифическое связывание антивидовых антител с антителами анализируемых проб. Тогда как оптическая плотность ПКО без добавления интактной сыворотки овцы в раствор конъюгата – 2,673, а ОКО 1,670, коэффициент позитивности Р – 1,6 (таблица 3).
Таблица 3 – Изучение стабилизирующего действия интактной сыворотки крови овцы на рабочий раствор конъюгата
|
Разведение раствора конъюгата |
Оптическая плотность (конъюгат с интактной сывороткой овцы) |
Р |
Оптическая плотность (конъюгат без интактной сыворотки овцы) |
Р |
||
|
ПКО |
ОКО |
ПКО |
ОКО |
|||
|
1:1 |
1,490±0,09 |
0,1±0,12 |
14,9 |
2,673±0,95 |
1,670±0,78 |
1,6 |
|
1:2 |
1,488±0,07 |
0,103±0,09 |
14,4 |
|||
|
1:4 |
1,485±0,14 |
0,105±0,07 |
14,1 |
|||
|
1:8 |
1,483±0,04 |
0,106±0,05 |
14,0 |
|||
|
1:10 |
1,480±0,05 |
0,108±0,03 |
13,7 |
|||
|
Примечание: Разведение сывороток – 1:25 |
||||||
Также было изучено влияние встряхивания планшета в термошейкере на специфичность и чувствительность реакции. Проводили ИФА с ПКО и ОКО без встряхивания и со встряхиванием при 100; 200; 400 и 600 об/мин (рис. 1).
|
А |
|
|
Б |
|
Рисунок 1 – Влияние режима встряхивания планшета в термошейкере А - на оптическую плотность ПКО и ОКО; Б - на коэффициент позитивности ПКО
Таким образом, установили, что чем выше скорость встряхивания, тем выше коэффициент Р РИД-положительной сыворотки, а также специфичность и чувствительность реакции.
Выводы. В результате проведенных экспериментов подобраны оптимальные параметры постановки непрямого твердофазного варианта ИФА для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Установлено, что водный раствор 2% глутарового альдегида повышает сорбционную активность планшета. Определены оптимальные концентрации вирусного антигена для сенсибилизации планшета, которая составляет 5 мкг/мл, блокирующего раствора – 0,5% интактная сыворотка овцы. Также данная сыворотка оказывает стабилизирующее действие на конъюгат и исключает неспецифическое взаимодействие антивидовых антител с антителами анализируемых сывороток. При постановке ИФА использование параметра встряхивания планшета на термошейкере по сравнению с условиями без встряхивания повышает чувствительность анализа. Оптимизированный вариант ИФА показал высокую специфичность и чувствительность.
Введение. Энзоотический лейкоз является одним из широко распространенных инфекционных заболеваний крупного рогатого скота в Российской Федерации [1]. Согласно официальным данным в России в 2023 году лейкоз крупного рогатого скота был зарегистрирован на территории 63 субъектов и зафиксировано 1584 новых неблагополучных пунктов [2]. В Республике Татарстан эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота оценивается как эндемичная [3].
Недостаточная диагностика является ведущим фактором низкой эффективности оздоровительных мероприятий в неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота хозяйствах [4]. Несмотря на внедрение в практику ветеринарных лаборатории современных методов диагностики лейкоза, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) [5], серологические методы занимают основное место в массовых диагностических исследованиях. Иммуноферментный анализ (ИФА) является высокочувствительным серологическим методом, который показал высокую эффективность при оздоровлении хозяйства от лейкоза крупного рогатого скота, когда возникает необходимость исследования большого количества образцов сывороток [6]. ИФА основан на индикации специфических антител в сыворотках крови животных, выявляемых при помощи антигенов вируса лейкоза крупного рогатого скота [7]. Основным средством получения антигенов gp51 и р24, используемыми в ИФА тест-системах для диагностики лейкоза скота является вирус, культивируемый в хронически инфицированной культуре клеток почек эмбриона овцы (FLK BLV) [8]. Однако несмотря на то, что метод ИФА широко применяется для эпизоотологического мониторинга лейкоза крупного рогатого скота и сконструированы различные варианты диагностических ИФА тест-систем, уменьшение ложноположительных и ложноотрицательных результатов анализа с параллельным улучшением диагностических параметров тест-системы, таких как чувствительность и специфичность имеют актуальность.
Целью данного исследования являлось усовершенствование условий постановки непрямого твердофазного ИФА для индикации специфических антител против вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Условия, материалы и методы. Антиген. В работе использовали антигенный материал вируса лейкоза крупного рогатого скота, полученный из FLK BLV и очищенный методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы [9].
Планшет. В качестве твердой фазы применяли стрипованные планшеты производства АО «Фирма Медполимер» (Россия).
Контрольные образцы. В качестве положительного контрольного образца (ПКО) и отрицательного контрольного образца (ОКО) использовали пробы сывороток крови крупного рогатого скота, которых исследовали коммерческими серологическими наборами и подтверждали наличие/отсутствие специфических антител против вируса лейкоза крупного рогатого скота. Также дополнительно от этих же животных отбирали кровь с целью установления наличия или отсутствия провирусной ДНК методом ПЦР [10].
Сыворотки. Для блокирования свободных центров связывания лунок планшета использовали интактную сыворотку овцы.
Концентрацию белка в овечьей сыворотке измеряли спектрофотометрическим методом с использованием для расчета эмпирической формулы Калькара.
Конъюгат антивидовых антител. В качестве конъюгата антивидовых антител был использован коммерческий препарат антивидовых антител кролика против иммуноглобулинов крупного рогатого скота, меченных ферментом пероксидазой, производства ООО «ИМТЭК» (Россия).
Непрямой вариант ИФА. Определение серологической активности полученного антигена в твердофазном непрямом ИФА осуществляли по общепринятой методике. Для повышения сорбционных свойств лунок планшета использовали глутаровый альдегид в виде 2% раствора на дистиллированной воде по 100 мкл на каждую лунку с инкубированием планшета 2 ч при температуре 37 ºС. После инкубации раствор глутарового альдегида сливали и планшет промывали один раз карбонатно-бикарбонатным буферным раствором (КББ), рН которого составил 9,5. После промывки осуществляли сенсибилизацию лунок планшета очищенным на градиенте плотности сахарозы антигеном в концентрациях от 1 до 20 мкг/мл. Антиген разводили на КББ (рН 9,5), объем раствора антигена для каждой лунки равнялся 100 мкл. Планшет с антигеном выдерживали при температуре от 2 °С до 8 °С в течение 16 ч. Далее раствор антигена сливали и планшет промывали один раз фосфатно-солевым буферным раствором ФСБ (рН-7,3) содержащим Твин-20 в концентрации 0,1% (ФСБ-Т). С целью блокировки свободных центров связывания лунок планшета использовали интактную сыворотку крови овцы, которую вносили по 100 мкл на каждую лунку и инкубировали планшет на термошейкере ELMI ST-3 (Латвия) в течение 2 ч при температуре 37 ºС и встряхиванием 300 об/мин. После инкубации раствор овечьей сыворотки сливали и планшет промывали один раз ФСБ-Т. Исследуемые сыворотки разводили на ФСБ-Т и планшет с сыворотками инкубировали на термошейкере в течение 45 мин при температуре 37 ºС и встряхиванием 600 об/мин. После чего сыворотки сливали и планшет промывали трехкратно ФСБ-Т. Для индикации образованных комплексов «антиген-антитело» использовали антивидовой конъюгат против иммуноглобулинов крупного рогатого скота. С целью стабилизации конъюгата его рабочее разведение (1:30000 согласно инструкции) разбавляли интактной сывороткой крови овцы в соотношении 1:10. Планшет с конъюгатом инкубировали в аналогичных для исследуемых сывороток крупного рогатого скота условиях. Далее раствор конъюгата сливали и планшет промывали пятикратно ФСБ-Т. Визуализацию образованных комплексов «антиген-антитело-антивидовое антитело» осуществляли добавлением в каждую лунку планшета по 100 мкл субстратного раствора с хромогенным компонентом тетраметилбензидином (ООО ИМТЭК, Россия) с выдерживанием планшета в течение 10 мин в темном месте. Для остановки реакции использовали 1М раствор серной кислоты. Оптическую плотность (ОП) исследуемых образцов определяли на спектрофотометре Multiskan Go Thermo Scientific (США) при длине волны 450 нм.
В качестве основного показателя, характеризующего позитивность анализируемой сыворотки крупного рогатого скота или наоборот, приняли коэффициент позитивности (Р) (отношение оптической плотности исследуемой сыворотки к оптической плотности отрицательного образца). Если коэффициент Р составил ≥ 2,2, то исследуемую сыворотку крупного рогатого скота приняли как положительную на содержание антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Образец интерпретировали как сомнительный, если Р варьировал от 2,0 до 2,2. В качестве отрицательного результата приняли значения коэффициента Р ≤ 2,0.
Результаты и обсуждение. С целью усовершенствования условий постановки непрямого варианта ИФА нами была проведена серия экспериментов по изучению влияния глутарового альдегида на сорбционные свойства планшета. Также определяли оптимальную концентрацию антигена вируса лейкоза для сенсибилизации планшета. Изучали блокирующие свойства интактной сыворотки крови овцы и влияние встряхивания планшета на чувствительность и специфичность ИФА
С целью повышения сорбции планшет инкубировали в течение 2 ч при 37 ºС 2% водным раствором глутарового альдегида. В данном исследовании глутаровый альдегид выполнял ключевую роль мостика для ковалентного соединения твердой фазы планшета и целевого белка вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Оптимальные параметры ИФА определяли методом титрования образцов ПКО и ОКО с разведения 1:25 до 1:3200. Для оценки эффективности сорбционной активности антигена определяли коэффициент позитивности (Р), который представляет собой отношение оптической плотности (ОП) ПКО к ОП ОКО (табл. 1).
Таблица 1 - Влияние глутарового альдегида да сорбционную активность планшета
|
Степень разведе- ния сыво-ротки |
Глутаровый альдегид |
Без глутарового альдегида |
||||
|
Оптическая плотность (М± SD) |
Р |
Оптическая плотность (М± SD) |
Р |
|||
|
ОКО |
ПКО |
ОКО |
ПКО |
|||
|
1:25 |
0,203±0,06 |
1,214±0,08 |
5,9 |
0,285±0,13 |
0,742±0,05 |
2,6 |
|
1:50 |
0,168±0,08 |
1,025±0,06 |
6,1 |
0,218±0,07 |
0,509±0,07 |
2,3 |
|
1:100 |
0,094±0,15 |
0,927±0,05 |
9,8 |
0,105±0,08 |
0,386±0,04 |
3,6 |
|
1:200 |
0,068±0,03 |
0,783±0,07 |
11,5 |
0,082±0,06 |
0,301±0,14 |
3,7 |
|
1:400 |
0,049±0,09 |
0,496±0,04 |
10,1 |
0,067±0,04 |
0,254±0,07 |
3,8 |
|
1:800 |
0,032±0,05 |
0,358±0,06 |
11,1 |
0,052±0,15 |
0,226±0,03 |
4,3 |
|
1:1600 |
0,024±0,07 |
0,227±0,04 |
9,4 |
0,036±0,09 |
0,171±0,05 |
4,7 |
|
1:3200 |
0,016±0,06 |
0,129±0,09 |
8,0 |
0,021±0,05 |
0,115±0,08 |
5,4 |
Из таблицы 1 видно, что 2% водный раствор глутарового альдегида повышает сорбционную активность планшета тем самым увеличивая коэффициент позитивности и в целом повышая чувствительность, а также специфичность ИФА.
Для определения оптимальной сенсибилизирующей концентрации антигена вируса лейкоза были использованы следующие его разведения: 1; 2,5; 5; 10 и 20 мкг/мл. Результаты ИФА показали, что наиболее оптимальная концентрация антигена составляет 5 мкг/мл, при которой оптическая плотность (ОП) ПКО составила 1,325, а ОКО – 0,280, а Р был равным 4,7 ед. Также следует отметить, что при концентрациях 2,5 и 1,0 мкг/мл антиген вируса лейкоза проявлял наиболее низкую серологическую активность, коэффициент отношения ОП отрицательного и контрольного образцов был равным 1,23 и 0,94 ед. соответственно.
По литературным данным известно, что в ИФА с целью блокирования свободных центров связывания лунок планшета для снижения неспецифических реакции используются такие белки как бычий сывороточный альбумин, желатин, казеин, а также сыворотка любого вида животного, обезжиренное сухое молоко [11]. Задачей следующего эксперимента было изучение блокирующей активности интактной овечьей сыворотки в 0,5, 1,0, 1,5 и 2,0 % концентрациях (по белку). Установили, что наиболее оптимальным в качестве блокирующего раствора является использование 0,5% интактной сыворотки овцы, при которой оптические показатели ОКО не превышали 0,104, а оптическая плотность ПКО равнялась 2,023, коэффициент Р – 19,4. Тогда как оптическая плотность ПКО без блокировки достигла 3,154, а ОКО – 1,76, коэффициент Р – 1,8 (табл. 2).
Таблица 2 – Подбор оптимальной концентрации интактной сыворотки овцы для блокирования остаточных центров связывания лунок планшета
|
Концентрация интактной сыворотки овцы (по белку), % |
Оптическая плотность |
Р |
Оптическая плотность (без блокирующего раствора) |
Р |
||
|
ПКО |
ОКО |
ПКО |
ОКО |
|||
|
0,5 |
2,023±0,08 |
0,104±0,03 |
19,4 |
3,154±0,76 |
1,76±0,56 |
1,8 |
|
1,0 |
1,814±0,05 |
0,099±0,07 |
18,3 |
|||
|
1,5 |
1,048±0,12 |
0,093±0,05 |
11,3 |
|||
|
2,0 |
0,968±0,07 |
0,086±0,09 |
11,2 |
|||
|
Примечание: Разведение сывороток – 1:25 |
||||||
С целью стабилизации конъюгата, рабочее разведение (1:30000) разбавляли интактной сывороткой крови овцы в соотношениях 1:1; 1:2; 1:4; 1:8 и 1:10. Для всех исследованных разведениях рабочего раствора конъюгата с интактной сывороткой овцы коэффициент позитивности составил выше 10, следовательно, данная сыворотка оказывает стабилизирующее действие на конъюгат и предотвращает неспецифическое связывание антивидовых антител с антителами анализируемых проб. Тогда как оптическая плотность ПКО без добавления интактной сыворотки овцы в раствор конъюгата – 2,673, а ОКО 1,670, коэффициент позитивности Р – 1,6 (таблица 3).
Таблица 3 – Изучение стабилизирующего действия интактной сыворотки крови овцы на рабочий раствор конъюгата
|
Разведение раствора конъюгата |
Оптическая плотность (конъюгат с интактной сывороткой овцы) |
Р |
Оптическая плотность (конъюгат без интактной сыворотки овцы) |
Р |
||
|
ПКО |
ОКО |
ПКО |
ОКО |
|||
|
1:1 |
1,490±0,09 |
0,1±0,12 |
14,9 |
2,673±0,95 |
1,670±0,78 |
1,6 |
|
1:2 |
1,488±0,07 |
0,103±0,09 |
14,4 |
|||
|
1:4 |
1,485±0,14 |
0,105±0,07 |
14,1 |
|||
|
1:8 |
1,483±0,04 |
0,106±0,05 |
14,0 |
|||
|
1:10 |
1,480±0,05 |
0,108±0,03 |
13,7 |
|||
|
Примечание: Разведение сывороток – 1:25 |
||||||
Также было изучено влияние встряхивания планшета в термошейкере на специфичность и чувствительность реакции. Проводили ИФА с ПКО и ОКО без встряхивания и со встряхиванием при 100; 200; 400 и 600 об/мин (рис. 1).
|
А |
|
|
Б |
|
Рисунок 1 – Влияние режима встряхивания планшета в термошейкере А - на оптическую плотность ПКО и ОКО; Б - на коэффициент позитивности ПКО
Таким образом, установили, что чем выше скорость встряхивания, тем выше коэффициент Р РИД-положительной сыворотки, а также специфичность и чувствительность реакции.
Выводы. В результате проведенных экспериментов подобраны оптимальные параметры постановки непрямого твердофазного варианта ИФА для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Установлено, что водный раствор 2% глутарового альдегида повышает сорбционную активность планшета. Определены оптимальные концентрации вирусного антигена для сенсибилизации планшета, которая составляет 5 мкг/мл, блокирующего раствора – 0,5% интактная сыворотка овцы. Также данная сыворотка оказывает стабилизирующее действие на конъюгат и исключает неспецифическое взаимодействие антивидовых антител с антителами анализируемых сывороток. При постановке ИФА использование параметра встряхивания планшета на термошейкере по сравнению с условиями без встряхивания повышает чувствительность анализа. Оптимизированный вариант ИФА показал высокую специфичность и чувствительность.
1. Shevchenko AA, Krivonos RA, Yakovenko PP. [On the issue of diagnosis of leukemia in cattle]. Veterinariya Kubani. 2023; 2. 9-11 p. https://doi.org/https://doi.org/10.33861/2071-8020-2023-2-9-11. EDN: https://elibrary.ru/QFKAEZ
2. The epizootic situation in the Russian Federation in 2022. [Internet]. FGBI VNIIZh AITs of the Department of Veterinary Supervision, Vladimir. [cited 2024, February 05]. Available from: https://fsvps.gov.ru/sites/default/files/files/iac/iac_epizooticheskaya_situaciya_v_rf_2022_god.pdf.
3. Gorbunova ME, Shangaraev RI, Dodonova EA. [Comparison of hematological parameters of cattle infected with various subgroups of the leukemia virus]. Veterinarnuy vrach. 2024; 1. 34-39 p. https://doi.org/ http://doihttps://doi.org/10.33632/1998-698X_2024_1_34. EDN: https://elibrary.ru/RPZAZW
4. Budulov NR, Mikailov MM, Gunashev Sh.A. [The current situation of bovine leukemia in Dagestan and methods of its diagnosis]. Veterinariya i kormlenie. 2023; 1. 14-18 p. https://doi.org/https://doi.org/10.30917/ATT-VK-1814-9588-2023-1-3. EDN: https://elibrary.ru/WLGMMF
5. Osipova NA, Agarkova TA, Dvoeglazov NG, Khramtsov VV. [Evaluation of the effectiveness of complex anti-leukemia measures in agricultural enterprises]. Sibirskiy Vestnik selskokhozyaystvennoy nauki. 2019; Vol.49. 5. 73-79 p. https://doi.org/https://doi.org/10.26898/0370-8799-2019-5-10. EDN: https://elibrary.ru/ICZGYE
6. Mustafaev AR, Baratov MO. [Comparative aspects of bovine leukemia diagnosis using immunodiffusion reaction and enzyme immunoassay]. Veterinariya segodnya. 2023; Vol.12. 1. 52-56 p. https://doi.org/https://doi.org/10.29326/2304-196X-2023-12-1-52-56. EDN: https://elibrary.ru/TMGXVS
7. Mikhaylova VV, Lobova TP, Skvortsova AN. [Comparison of serological methods of laboratory diagnosis of bovine leukemia]. Molochnoe i myasnoe skotovodstvo. 2020; 2. 51-52 p. https://doi.org/https://doi.org/10.33943/MMS.2020.80.52.011. EDN: https://elibrary.ru/CMMJUU
8. Kovalenko AM, Yavnikov NV, Petropavlovskiy MV. [Early diagnosis of animals infected with bovine leukemia virus is the key to successful farm recovery]. Veterinariya Kubani. 2020; 6: 8-12 p. https://doi.org/https://doi.org/10.33861/2071-8020-2020-6-8-12. EDN: https://elibrary.ru/NPBBZD
9. Gorbunova ME, Usoltsev KV, Shangaraev RI. [Purification of bovine leukemia virus antigens by ultracentrifugation]. Veterinarnuy vrach. 2024; 2. 43-48 p. https://doi.org/https://doi.org/10.33632/1998-698X_2024_2_43. EDN: https://elibrary.ru/WDIPNK
10. Mikailov MM, Budulov NR, Gunashev ShA. [Efficiency of reaction of immunodiffusion and PCR methods in the diagnosis of bovine leukemia virus]. Veterinariya Kubani. 2022; 5. 3-5 p. https://doi.org/https://doi.org/10.33861/2071-8020-2022-5-3-5. EDN: https://elibrary.ru/RZFNWK
11. Loginov SI. [Analysis of the effectiveness of enzyme immunoassay for the diagnosis of bovine leukemia during recreational activities]. Vestnik NGAU. 2020; 4(57). 95-102 p. https://doi.org/https://doi.org/10.31677/2072-6724-2020-57-4-95-102. EDN: https://elibrary.ru/KKUMZA
