UDC 579.62
UDC 636
The work assesses the vaginal microbiocenosis in cattle with normal and pathological postpartum period. The material for the research was scrapings of the vaginal mucosa from heifers with 2-3 months of pregnancy (n=6), first-calf heifers with physiological postpartum period (n=6) and with signs of endometritis (n=6). The microbiome was studied by real-time PCR using the Femoflor® 16 medical test system. It was found that the vaginal microbiocenosis of cattle before the first calving is characterized by a wide range of microorganisms with potential pathogenicity and are capable of initiating inflammatory processes in the reproductive organs. In the physiological conditions of the postpartum period, there is a significant decrease in both the total bacterial contamination (by 106.60; p≤0.05) and the quantitative content of individual representatives of the microbiome. In the case of endometritis, an increase in the number of most microorganisms that make up the biocenosis is noted (by 106.76). The concentration of streptococci, regardless of the postpartum period characteristics, is characterized by a lower indicator by 103.26 ... 103.38 (p ≤ 0.05) compared to the pregnancy period, but in case of inflammation of the genital tract it exceeds the level of healthy animals by 102.77 (p≤0.001). Comparative analysis showed that in the absence of postpartum pathology of the uterus, a relative increase in the level of opportunistic species occurs in the vagina, which is associated with changes in the ratio between microorganisms diagnosed and not diagnosed by the test system. With endometritis, a more pronounced decrease in the amount of unidentifiable microbial DNA and an increase in the number of such representatives as Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia and Porphyromonas spp., which have pathogenic potential and are capable of causing bacterial vaginitis, are observed.
cattle, vaginal microbiocenosis, polymerase chain reaction, postpartum period, endometritis
Введение. Генетически детерминированный рост молочной продуктивности крупного рогатого скота ассоциирован со снижением репродуктивного потенциала [1, 2]. На фоне метаболических нарушений, у животных наблюдается повышенная чувствительность к различным заболеваниям, как инфекционного, так и неинфекционного характера, включая патологии репродуктивных органов, которые ведут к снижению фертильности [3, 4].
Среди наиболее распространенных причин симптоматического бесплодия у коров выделяются воспалительные процессы репродуктивной системы, такие как острые и хронические метриты, возникающие в результате инфицирования органа патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. Контаминация матки, как правило, осуществляется в процессе родов и в раннем послеродовом периоде, в том числе восходящим и контактным путями из нестерильного влагалища [5, 6, 7].
Микрофлора влагалища представляет собой сложный биоценоз, способствующий естественной резистентности организма и поддерживающий репродуктивное здоровье [8, 9, 10]. Важность влагалищной микрофлоры в колонизации пищеварительных и дыхательных органов новорожденных подчеркивает ее влияние на жизнеспособность потомства [11, 12]. Микробный состав влагалища определяется множеством факторов, особенно физиологическим состоянием самки [13]. Таким образом, для понимания биологической роли вагинального биоценоза и разработки методов диагностики, профилактики и лечения репродуктивных патологий необходимо детальное изучение микробного сообщества в различные периоды онтогенеза [14, 15]. Исследования микрофлоры влагалища коров и телок при различных состояниях репродуктивных органов представляют особую ценность для ветеринарной науки, при этом необходимо учитывать, что традиционные методы не всегда обеспечивают полноценное описание микробного состава. Наиболее эффективным подходом к оценке микробиоценозов являются методы, основанные на выявлении и идентификации микробной ДНК [16, 17].
Цель исследований – дать характеристику микробиоценоза влагалища у крупного рогатого скота при нормальном и патологическом течении послеродового периода.
Условия, материалы и методы. Исследования проведены в 2024 году в лаборатории сельскохозяйственной геномики Института агробиотехнологий им. А.В. Журавского Коми НЦ УрО РАН. Объектом исследований служил голштинизированный крупный рогатый скот холмогорской породы, принадлежащий ООО «Межадорское» Сысольского района Республики Коми. Средняя молочная продуктивность стада по результатам 2023 года составила более 9200 кг молока в год. С помощью случайной выборки была сформирована группа нетелей (n=6 гол.), группа коров-первотелок с нормальным течением послеродового периода (n=6 гол.) и группа животных, у которой были выявлены признаки острого гнойно-катарального эндометрита (n=6 гол.). Оценка состояния репродуктивных органов проводилась с использованием трансректальной ультразвуковой сонографии УЗ-сканером Easi-Scan 4.0, а в послеродовой период дополнительно оценивался характер влагалищно-маточного содержимого с помощью акушерской ложки Панкова.
Материал для исследований от нетелей получали в 2…3 месячной срок стельности, а от новотельных коров – на 14…20 день послеродового периода. Для этого, после проведения туалета наружных половых органов от животных стерильной ложкой Люера, с заднебокового свода влагалища брали соскоб слизистой, 100 мкл полученной массы насасывали стерильным инсулиновым шприцом и помещали в пробирку типа Эппендорф содержащей 500 мкл муколитической транспортной среды «Стор-М» (ООО «ДНК-Технология» г. Москва). Пробирки доставляли в лабораторию, гомогенизировали путем встряхивания, центрифугировали при 15 тыс. об. в течение 10 минут, после чего надосадочную жидкость удаляли с таким расчетом, чтоб в пробирке осталось 100 мкл содержимого. Выделение ДНК проводили с использованием набора «Проба-НК-Плюс» (ООО «ДНК-Технология» г. Москва) согласно инструкции производителя. Исследование микробиоценоза влагалища крупного рогатого скота осуществляли путем постановки ПЦР в реальном времени с применением медицинской тест-системы Фемофлор® 16 (ООО «ДНК-Технология» г. Москва). ПЦР проводили на детектирующем амплификаторе «ДТлайт 4S1» в режиме, рекомендованном производителем для данного набора. Специфичность генотипирования проверяли контрольными образцами, входящими в состав диагностического комплекта.
Цифровой материал обработан методом вариационной статистики на достоверность различия сравниваемых показателей в программе Microsoft Excel с использованием критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Характеристика микробиоты влагалища у крупного рогатого скота, установленная путем ПЦР-анализа, представлена в таблице 1. Как показала молекулярно-генетическая оценка, в образцах слизистой, которые подвергались исследованию, не были обнаружены молочнокислые бактерии, выступающие в роли основных симбионтов влагалища человека. Так же в соскобах слизистой исследуемых животных не были идентифицированы возбудители микоплазменной урогенитальной инфекции.
Установлено, что при нормальном течении послеродового периода наблюдается выраженное снижение микробной загрязненности слизистой оболочки влагалища. Так, общее количество генетического материала микроорганизмов уменьшалось на 106,60 (р≤0,05), по сравнению с показателем на момент первой стельности. В случае развития воспалительного процесса общая бактериальная масса наоборот увеличивалась на 106,76, по отношению к значениям до отела, и на 106,99 (р≤0,05) по отношению к показателю здоровых животных. Количество не идентифицированных микроорганизмов при физиологическом течении послеродового периода снижалось на 106,43 (р≤0,05), а при патологическом на 106,00, таким образом, превосходя значения второй группы на 106,23 (р≤0,05).
Анализ концентрации факультативно-анаэробных микроорганизмов свидетельствует, что содержание стрептококков, независимо от особенностей течения послеродового периода, характеризуется меньшим на 103,26…103,38 (р≤0,05) показателем, однако при воспалении полового тракта превосходит уровень здоровых животных на 102,77 (р≤0,001). Содержание бактерий семейства Enterobacteriaceae по окончанию гестации снижается на 105,10…105,29, при этом у животных с послеродовой патологией их количество было выше на 104,86 (р≤0,05), по сравнению с первотелками без осложнений. В пробах, полученных от нетелей, геном стафилококков не был выявлен в детектируемом количестве, тогда как в послеродовом периоде, независимо от его течения, происходило увеличение численности данного микроорганизма на 103,11…103,43 (р≤0,001), при этом у животных с эндометритом концентрация данного кокка была на 103,15 (р≤0,05) выше показателя здоровых первотелок.
Таблица 1 – Результаты исследования микробиоценоза влагалища крупного рогатого скота ПЦР-методом при нормальном течение послеродового периода и при эндометрите
|
Группа микроорганизмов |
Концентрация ДНК-геномов 1×10е/г |
Достоверность различий между группами (P) |
||||
|
1 группа (нетели) |
2 группа (здоровые первотелки) |
3 группа (заболевшие первотеки) |
1-2 |
1-3 |
2-3 |
|
|
Общая микробная масса |
6,63±6,24 |
5,45±4,19 |
7,00±6,46 |
0,05 |
н/д |
0,05 |
|
Не идентифицированные микроорганизмы |
6,45±6,10 |
5,10±4,40 |
6,26±5,65 |
0,05 |
н/д |
0,05 |
|
Нормофлора |
||||||
|
Lactobacillus spp. |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
Факультативно-анаэробные микроорганизмы |
||||||
|
сем. Enterobacteriaceae |
5,30±4,97 |
3,38±2,57 |
4,87±4,20 |
0,05 |
н/д |
0,05 |
|
Streptococcus spp. |
3,52±2,91 |
2,95±1,69 |
3,17±1,80 |
0,05 |
0,05 |
0,001 |
|
Staphylococcus spp. |
- |
3,11±2,14 |
3,43±2,61 |
0,001 |
0,001 |
0,01 |
|
Облигатно-анаэробные микроорганизмы |
||||||
|
Gardnerella vaginalis+Prevotella bivia+Porphyromonas spp. |
5,56±5,10 |
4,46±4,00 |
6,75±6,31 |
0,05 |
0,05 |
0,05 |
|
Eubacterium spp. |
4,58±3,77 |
4,34±3,65 |
5,40±4,70 |
0,05 |
0,01 |
0,01 |
|
Sneathia spp.+Leptotrichia spp.+Fusobacterium spp. |
5,70±5,37 |
4,51±4,17 |
5,20±4,87 |
н/д |
н/д |
н/д |
|
Megasphaera spp.+Veillonella spp.+Dialister spp. |
4,14±3,45 |
3,52±2,91 |
5,47±4,99 |
0,01 |
0,05 |
0,05 |
|
Lachnobacterium spp.и Clostridium spp. |
5,34±4,65 |
4,64±3,95 |
6,23±5,64 |
0,01 |
0,01 |
0,01 |
|
Mobiluncus spp.+Corynebacterium spp. |
3,91±2,94 |
3,95±2,69 |
3,98±3,26 |
н/д |
н/д |
н/д |
|
Peptostreptococcus spp. |
4,55±3,29 |
4,05±2,79 |
5,27±4,60 |
0,001 |
0,01 |
0,01 |
|
Atopobium vaginae |
1,95±0,69 |
1,48±0,67 |
2,28±1,26 |
0,001 |
0,001 |
0,001 |
|
Дрожжеподобные грибы |
||||||
|
Candida spp. |
3,11±2,14 |
3,25±1,99 |
3,25±2,34 |
0,05 |
н/д |
н/д |
|
Микоплазмы (качественный анализ) |
||||||
|
Mycoplasma hominis |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
Mycoplasma genitalium |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
Ureaplasma urealyticum + Ureaplasma parvum |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Количество облигатно-анаэробных микроорганизмов, таких как Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia, Porphyromonas spp. у животных с нормальным течением лохиального периода снижалось на 105,52 (р≤0,05), а при остром эндометрите наоборот увеличивалось на 106,72(р≤0,05). Содержание эубактерий у здоровых животных на 105,36(р≤0,01) было меньше показателя больных, пептострептококков на 105,24(р≤0,01), бактерий рода Atopobium на 102,21 (р≤0,001). Концентрация генетического материала таких микроорганизмов как Megasphaera spp., Veillonella spp. и Dialister spp. при воспалении матки увеличивалась на 105,45(р≤0,01), а при отсутствии послеродовой патологии наоборот снижалась на 104,02(р≤0,05). Схожая динамика наблюдалась по отношению к бактериям рода Lachnobacterium и Clostridium: снижение показателя у здоровых первотелок (на 105,24; р≤0,01) и рост у заболевших (на 106,17; р≤0,01). Содержание грибов рода Candida не зависимо от течения послеродового периода увеличивалось на 102,69, при этом у здоровых животных разница была достоверной (р≤0,05). Изменения концентраций других групп микроорганизмов не демонстрировали статистически значимых вариаций.
На следующем этапе была осуществлена сравнительная оценка содержания геномов представителей вагинального микробиоценоза относительно общей выделенной микробной ДНК (табл. 2).
Таблица 2 – Относительное содержание идентифицированной ДНК микроорганизмов в соскобе слизистой влагалища, относительно общей массы ДНК
|
Группа микроорганизмов |
Относительное содержание микроорганизмов, % |
Разница между значениями |
||||
|
1 группа (до отела) |
2 группа (нормальное течение) |
3 группа (воспаление матки) |
1-2 |
1-3 |
2-3 |
|
|
Не идентифицированные микроорганизмы |
53,43 ±7,32 |
43,00 ±6,50 |
22,49 ±7,33 |
-10,43 |
-30,94** |
-20,51* |
|
сем. Enterobacteriaceae |
2,66 ±1,11 |
0,88 ±0,18 |
1,15 ±0,40 |
-1,78 |
-1,51 |
+0,27 |
|
Streptococcus spp. |
0,19 ±0,06 |
0,32 ±0,00 |
0,02 ±0,00 |
+0,13* |
-0,17* |
0,30*** |
|
Staphylococcus spp. |
0,00 ±0,00 |
0,45 ±0,02 |
0,03 ±0,01 |
+0,45*** |
+0,03* |
0,42*** |
|
Gardnerella vaginalis+Prevotella bivia+Porphyromonas spp. |
13,95 ±2,83 |
11,23 ±4,11 |
48,28 ±5,27 |
-2,72 |
+34,33*** |
+37,05*** |
|
Eubacterium spp. |
2,82 ±1,03 |
8,29 ±2,03 |
3,00 ±0,58 |
+5,47* |
+0,18 |
-5,29* |
|
Sneathia spp.+Leptotrichia spp.+Fusobacterium spp. |
6,49 ±2,87 |
10,18 ±4,61 |
2,10 ±1,21 |
+3,69 |
-4,39 |
-8,08 |
|
Megasphaera spp.+Veillonella spp.+Dialister spp. |
0,92 ±0,31 |
1,25 ±0,35 |
2,77 ±0,22 |
+0,33 |
+1,85*** |
+1,52* |
|
Lachnobacterium spp.+Clostridium spp. |
14,55 ±4,98 |
16,53 ±4,05 |
17,85 ±2,17 |
+1,98 |
+3,3 |
+1,32 |
|
Mobiluncus spp.+Corynebacterium spp. |
0,69 ±0,27 |
3,25 ±0,35 |
0,16 ±0,05 |
+2,56*** |
-0,53 |
-3,09*** |
|
Peptostreptococcus spp. |
4,17 ±1,78 |
3,98 ±0,00 |
2,11 ±0,30 |
-0,19 |
-2,06 |
-1,87*** |
|
Atopobium vaginae |
0,01 ±0,00 |
0,01 ±0,00 |
0,01 ±0,00 |
0,00 |
0,00 |
0,00 |
|
Candida spp. |
0,11 ±0,04 |
0,65 ±0,07 |
0,02 ±0,00 |
+0,54*** |
-0,09* |
-0,63*** |
Примечание: разница достоверна *р≤0,05, **р≤0,01; ***р≤0,001
Установлено, что после родов процентное содержание не идентифицированных микроорганизмов снижается у всех животных, однако более выражено это происходит при воспалении матки (на 30,94 абс.%; р≤0,01). В процессе нормального течения послеродового периода было зафиксировано увеличение относительной доли стрептококков на 0,13 абс. % (р≤0,05), в то время как при возникновении эндометрита этот показатель продемонстрировал снижение на 0,17 абс. % (р≤0,05). Таким образом, разница между второй и третьей группой составила 0,30 абс.% (р≤0,001). Аналогичная тенденция наблюдалась и в отношении стафилококков: у здоровых особей уровень оказался на 0,42 абс.% выше (р≤0,001) по сравнению с первотёлками, у которых диагностирован послеродовой метрит. Доля бактерий рода Gardnerella, Prevotella и Porphyromonas, при физиологическом течении лохиального периода оставалась на стабильном уровне. В то же время, в условиях воспаления слизистой оболочки матки наблюдалось значительное увеличение относительной концентрации данных представителей на 34,33 абс.% (р≤0,001). У здоровых коров наблюдался рост эубактерий на 5,47 абс.% (р≤0,05), бактерий рода Mobiluncus и Corynebacterium на 2,56 абс.% (р≤0,001), дрожжеподобных грибов на 0,54 абс.% (р≤0,001), тогда как у заболевших послеродовой патологией животных относительное количество указанных микроорганизмов было ниже показателя коров без патологии на 5,29 (р≤0,05), 3,09 (р≤0,001) и 0,63 (р≤0,001) абс.% соответственно. Процентное содержание бактерий рода Megasphaera spp., Veillonella spp. и Dialister spp., оставалось на стабильном уровне при отсутствии послеродовых осложнений, однако в случаях возникновения эндометрита наблюдался рост на 1,85 абс.% (р≤0,001). В то же время относительная концентрация пептострептококков при наличии воспалительного процесса в матке была на 1,87 абс.% (р≤0,001) ниже по сравнению с показателями здоровых коров.
Выводы. Проведенные ПЦР исследования свидетельствуют, что еще до момента первого отела микробиоценоз влагалища крупного рогатого скота представлен широким спектром микроорганизмов, потенциально способных вызвать воспалительную патологию органов размножения. При физиологическом течении послеродового периода наблюдается снижение, как общей бактериальной загрязненности, так и количества отдельных представителей микробиома, а на фоне возникновении эндометрита происходит увеличение численности большинства микроорганизмов, составляющих биоценоз. Сравнительная оценка показывает, что при отсутствии послеродовой патологии матки в полости влагалища наблюдается относительный рост уровня условно-патогенных видов, что связано с изменением соотношения между микроорганизмами, которые диагностируются и не диагностируются используемой тест-системой. При эндометрите отмечается более выраженное уменьшение количества неидентифицируемой микробной ДНК и рост числа таких представителей, как Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia и Porphyromonas spp, способных вызвать бактериальный вагинит.
1. Naryshkina EN, Sermyagin AA, Yanchukov IN. [The influence of genetic and paratypic factors on qualitative and quantitative indicators of semen of breeding bulls]. Molochnoe i myasnoe skotovodstvo. 2017; 4. 15-19 p. EDN: https://elibrary.ru/YTDPLH
2. Sermyagin AA, Naryshkina EN, Nedashkovskiy IS. [Evaluation of Holstein effect in the population of black-and-white cattle in Moscow region]. AgroZooTekhnika. 2018; Vol.1. 3. 1 p. https://doi.org/10.15838/alt.2018.1.3.1. EDN: https://elibrary.ru/VLHACJ
3. Konopeltsev IG, Shupletsova NN, Sapozhnikov AF. [Reproductive function of first-calf heifers against the background of the use of selenoline, sedimin and eleovit]. Voprosy normativno-pravovogo regulirovaniya v veterinarii. 2015; 2. 207-210 p. EDN: https://elibrary.ru/TWNHBH
4. Nikolaev SV, Konopeltsev IG. [Mathematical method for assessing the reproductive function of cattle]. Genetika i razvedenie zhivotnykh. 2019; 4. 14-19 p. https://doi.org/10.31043/2410-2733-2019-3-3-10 EDN: https://elibrary.ru/BDHQBC
5. Koba IS, Reshetka MB, Dubovikova MS. [Etiology and pathogenesis of postpartum endometritis of cows]. Vestnik APK Stavropolya. 2015; 4(20). 95-98 p. EDN: https://elibrary.ru/VHWPRR
6. Parshin PA, Vostroilova GA, Brigadirov YuN. [Microbial landscape of the genital tract of healthy cows with different gestation periods]. Mezhdunarodnyy vestnik veterinarii. 2023; 4. 431-437 p. https://doi.org/10.52419/issn2072-2419.2023.4.431 EDN: https://elibrary.ru/MMEWRE
7. Skorikov VN, Manzhurina OA, Mikhalev VI. [Etiological structure of postpartum metritis of dairy cows with different exploitation technologies]. Uchenye zapiski uchrezhdeniya obrazovaniya Vitebskaya ordena Znak pocheta gosudarstvennaya akademiya veterinarnoy meditsiny. 2023; Vol.59. 4. 46-50 p. https://doi.org/10.52368/2078-0109-2023-59-4-46-50 EDN: https://elibrary.ru/NNJZSS
8. Melkumyan AR, Priputnevich TV, Ankirskaya AS. [Species composition of lactobacilli in different states of the vaginal microbiota in pregnant]. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2013; Vol.15. 1. 72-79 p. EDN: https://elibrary.ru/PWYZHV
9. Boris S, Barbes C. Role played by lactobacilli in controlling the population of vaginal pathogens. Microbes and Infection. 2000; 2. 543-546 p. https://doi.org/10.1016/s1286-4579(00)00313-0
10. Verstraelen H, Verhelst R, Claeys G. Longitudinal analysis of the vaginal microflora in pregnancy suggests that L crispatus promotes the stability of the normal vaginal microflora and that L gasseri and/or L iners are more conducive to the occurrence of abnormal vaginal microflora. BMC Microbiology. 2009; 9 (116). https://doi.org/10.1186/1471-2180-9-116 EDN: https://elibrary.ru/OUTNBR
11. Deng F, McClure M, Rorie R. The vaginal and fecal microbiomes are related to pregnancy status in beef heifers. Journal of Animal Science and Biotechnology. 2019; 10 (92). https://doi.org/10.1093/jas/sky404.087 DOI: https://doi.org/10.1186/s40104-019-0401-2; EDN: https://elibrary.ru/AIXBUZ
12. Zhukov MS, Alekhin YuN. Detection of the upper respiratory tract bacteria in new born calves. Reproduction in domestic animals. 2022; 57 (S1). 97 p. http://doi.org/10.1111/rda.14052 EDN: https://elibrary.ru/EBHLEG
13. Lozovaya EG. [Immunodeficiency and vaginal dysbiosis in the manifestation of intrauterine growth retardation and embryo death of cows]. Vestnik Voronezhskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2017; 1(52). 55-60 p. https://doi.org/10.17238/issn2071-2243.2017.1.55 EDN: https://elibrary.ru/YQUNVP
14. Khamidullin RR, Tremasova AM, Idiyatov II. [Microbiocenosis of the genital tract of cows with acute postpartum endometritis]. Veterinarnyy vrach. 2023; 1. 64-69 p. http://doi.org/10.33632/1998-698X_2023_1_64 EDN: https://elibrary.ru/KYPNXO
15. Shakhov AG, Sashnina LYu, Erina TA. [Correction of vaginal biocenosis in late-calving cows using probiotics giprolam and symbiter-2]. Selskokhozyaystvennaya biologiya. 2018; Vol.53. 2. 414-421 p. https://doi.org/10.15389/agrobiology.2018.2.414rus EDN: https://elibrary.ru/XOQVAL
16. Laptev GYu, Novikova NI, Ilina LA. [Study of vaginal mucus of highly productive cows in the post-calving period using real-time PCR]. Rossiyskiy veterinarnyy zhurnal. Selskokhozyaystvennye zhivotnye. 2014; 3. 10-12 p. EDN: https://elibrary.ru/SLSCSR
17. Laptev GYu, Novikova NI, Ilina LA. [Comparative analysis of vaginal microbiocenosis of cows using REAL-TIME PCR]. Veterinariya. 2014; 8. 33-37 p. EDN: https://elibrary.ru/SKSHPB
