IN VITRO И IN VIVO ОЦЕНКА РАДИОХИМИЧЕСКОГО СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ МЕЧЕННОГО 99MTС КАРКАСНОГО БЕЛКА DARPIN9_29 ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОБРАЗОВАНИЙ С ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ HER2/NEU
Аннотация и ключевые слова
Аннотация (русский):
Введение: Для обеспечения направленной доставки радионуклидов при диагностике злокачественных новообразований активно используют молекулы, связывающиеся со специфическим «таргетным» антигеном. В последние годы исследуется возможность применения для этих целей адресных молекулярных структур DARPin (Design Ankyrin Repeat Protein). Одной из наиболее изучаемых молекулярных мишеней по-прежнему остается рецептор эпидермального роста Her2/neu, гиперэкспрессия которого определяется на поверхности опухолевых клеток. Цель: Изучение эффективности радиохимического соединения на основе меченных 99mTc адресных молекул DARPin9_29 для радионуклидной диагностики злокачественных опухолей с гиперэкспрессией Her2/neu. Материал и методы: Последовательность DARPin9_29 была амплифицирована с плазмиды pET-DARP-6HIS для экспрессии гена DARPin9_29-His6 в клетках E. coli. Элюат 99mTcO4- (400–500 мкл, 4 ГБк) был добавлен в набор для приготовления трикарбонила технеция [99mTc(H2O)3(CO)3]+ (CRS Kit, Швейцария) с последующей инкубацией при температуре 100 °С в течение 20 мин. После инкубации 40 мкл [99mTc(H2O)3(CO)3]+ было добавлено к 168 мкг DARPin9_29 в 100 мкл PBS (натрий-фосфатный буфер) с последующей инкубацией при температуре 40 °С в течение 60 мин. Радиохимические выход и чистота определялись с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ), очищение проводилось с использованием очищающих колонок NAP-5 (GE Healthcare, Швеция). Для изучения специфичности исследуемого радиофармацевтического соединения использовались клеточные линии с различным уровнем экспрессии Her2/neu: SKOV-3 > BT474 >> DU-145. Для проведения in vitro исследования использовалась экспрессирующая Her2/neu клеточная линия SKOV-3. Исследование проводилось через 6 ч после введения препарата. Результаты: Радиохимический выход составил 72 ± 8 %, радиохимическая чистота после очищения – 98,7 ± 1,0 %. Показатели стабильности в растворе PBS через 1 ч составили 99,8 ± 0,2; через 3 ч – 98,2 ± 0,1. Данные in vitro исследований продемонстрировали, что накопление изучаемого соединения прямо пропорционально уровню экспрессии Her2/neu клеток, при этом при блокировании рецепторов избытком немеченого протеина отмечается значительное снижение связывания в группе клеток. Данные по биораспределению и ОФЭКТ/КТ в организме животного BALB/c nu/nu через 6 ч после введения радиофармпрепарата продемонстрировали быстрое выведение соединения из кровотока и высокую аккумуляцию в опухоли, печени, почках и мочевом пузыре. Заключение: Проведенные исследования продемонстрировали высокие показатели радиохимического выхода и чистоты, а также стабильность изучаемого соединения. Результаты in vitro и in vivo анализа показали специфичность и аффинность радиофармпрепарата к рецептору Her2/neu на поверхности опухолевых клеток. Выявленная при in vivo исследованиях высокая аккумуляция препарата в печени и почках, вероятно, обусловлена липофильностью 99mTc(CO)3-, связанной с гексагистидиновым концом, и свидетельствует об ограничении его дальнейшего клинического использования в оценке состояния указанных выше органов, что потребует дополнительных методов диагностики, а также возможной модификации химической структуры.

Ключевые слова:
злокачественные опухоли, Her2/neu, радионуклидная диагностика, DARPin9_29
Список литературы

1. Чернов В.И., Медведева А.А., Синилкин И.Г. и соавт. Ядерная медицина в диагностике и адресной терапии злокачественных новообразований // Бюллетень сибирской медицины. 2018. Т. 17. №1. С. 220-231.

2. Чернов В.И., Брагина О.Д., Синилкин И.Г. и соавт. Радиоиммунотерапия: современное состояние проблемы // Вопросы онкологии. 2016. Т. 62. № 1. С. 24-30.

3. Чернов В.И., Брагина О.Д., Синилкин И.Г. и соавт. Радиоиммунотерапия в лечении злокачественных образований // Сибирский онкологический журнал. 2016. Т. 15. №2. С. 101-106.

4. Tamaskovic R., Simon M., Stefan N. et.al. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins) from research to therapy // Methods Enzymol. 2012. Vol. 503. P. 101-134.

5. Boersma Y.L., Pluckthun A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications // Curr. Opin. Biotechnol. 2011. Vol. 22. P. 849-57.

6. Брагина О.Д., Ларькина М.С., Стасюк Е.С. и соавт. Разработка высокоспецифичного радиохимического соединения на основе меченых 99mТс рекомбинантных адресных молекул для визуализации клеток с гиперэкспрессией Her-2/neu // Бюллетень сибирской медицины. 2017. Т.16. №3. С. 25-33.

7. Bragina O., Larkina M., Stasyuk E. et.al. In vitro evaluation of a specific radiochemical compound based on 99mTc-labeled DARPinG3 for radionuclide imaging of tumors overexpressing Her-2/neu // AIP Conference Proceedings. 2017. 1882. 020007. https://doi.org/10.1063/1.5001586.

8. Goldstein R., Sosabowski J., Livanos M. et.al. Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 for HER2 molecular imaging // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 2015. Vol. 42. P. 288-301.

9. Lindbo S., Garousi J., Mitran B. et.al. Radionuclide Tumor Targeting Using ADAPT Scaffold Proteins: Aspects of Label Positioning and Residualizing Properties of the Label // J. Nucl. Med. 2018. Vol. 59. № 1. P. 93-99.

10. Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015. Vol. 55. P. 489-511.

11. Garousi J., Honarvar H., Andersson K.G. et.al. Comparative Evaluation of Affibody Molecules for Radionuclide Imaging of in Vivo Expression of Carbonic Anhydrase IX // Mol Pharm. 2016. Vol.13. № 11. P. 3676-3687.

12. Nicholes N., Date A., Beaujean P. et.al. Modular protein switches derived from antibody mimetic proteins // Protein Engineering, Design and Selection. 2016. Vol. 29. P. 77-85.

13. Kramer L., Renko M., Završnik J. et.al. Non-invasive in vivo imaging of tumour-associated cathepsin B by a highly selective inhibitory DARPin // Theranostics. 2017. Vol. 8. P. 2806-2821.

14. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G. et.al. Human breast cancer: correlation of relapse a survival with amplification of the Her-2/neu oncogenes // Science. 1987. Vol. 235. P. 177-182.

15. Zavyalova M., Vtorushin S., Krakhmal N., et.al. // Clinicopathological features of nonspecific invasive breast cancer according to its molecular subtypes. Experimental Oncology. 2016. Vol. 38. № 2. P. 122-127.

16. Babyshkina N., Malinovskaya E., Cherdinceva N., et.al. Neoadjuvant chemotherapy for different molecular breast cancer subtypes: a retrospective study in Russian population // Medical Oncology. 2014. Vol. 31. №9. P. 1-12.

17. Чернов В.И., Брагина О.Д., Синилкин И.Г. и соавт. Радионуклидная тераностика злокачественных образований // Вестник рентгенологии и радиологии. 2016. Т. 97. №5. С. 306-313.

18. Tamaskovic R., Simon M., Stefan N., Schwill M., Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins) from research to therapy. Methods Enzymol. 2012; 503: 101-34.

Войти или Создать
* Забыли пароль?