Формирование современными доказательными исследованиями фенотипов бронхиальной астмы (БА),дифференцируемых по клиническим проявлениям, ведущему триггеру и характеру воспаления дыхательныхпутей, существенно расширило представления о гетерогенности природы заболевания, позволив разработатьряд безопасных и высокоэффективных средств терапии [2, 7, 16, 19, 20]. Несмотря на внедрение предлагаемыхновых фармакологических программ, в условиях реальной клинической практики сохраняется возможностьтерапевтических неудач и трудности достижения хорошего контроля болезни [11, 14, 15]. В этой связи остаётсяактуальной в аспекте прогноза течения заболевания проблема воспаления дыхательных путей со свойственнойему манифестацией не только на локальном, но и на системном уровне.В работах по диагностическому значению морфологического фенотипирования БА нейтрофильныйфенотип считается наиболее присущим во время обострения болезни, тогда как период ремиссии ассоциируетсяс эозинофильным воспалительным фенотипом, сопровождающим хороший ответ пациентов на лечениеингаляционными глюкокортикостероидами (ИГКС) и анти-IL-5 препаратами [7]. Согласно данным рядаисследований, посвящённых клинико-морфологической концепции холодовой гиперреактивности дыхательныхпутей (ХГДП), нейтрофилия бронхиального инфильтрата при БА является фактором инициации и нарастаниярезистентности к ИГКС. В условиях нейтрофилии происходит усугубление воспалительной реакции в бронхахи, как следствие, клинических проявлений астмы, снижается уровень контроля над болезнью, отмечаетсяухудшение проходимости дыхательных путей и увеличение частоты развития реакции бронхов на холодовойстимул [3, 5]. Между тем, оба звена популяции гранулярных лейкоцитов – как нейтрофилы, так и эозинофилы –в равной степени рассматриваются в роли эффекторов базисных явлений патогенеза БА – воспаления иоксидативного стресса. Гранулоциты генерируют окислительные процессы, продуцируют активные формыкислорода и свободные радикалы, синтезируют и активируют провоспалительные медиаторы, участвуяпосредством синергических и антагонистических взаимодействий Тh2 и Тh1 типов цитокинов в регуляцииответа бронхов на триггер [10].Определённый интерес представляет проблема взаимоотношений локального и системногоэозинофильного воспаления у больных БА, с большой вероятностью подвергающегося изменениям при холод-индуцированном бронхоспазме, с клиническими и патофизиологическими параметрами болезни. Предстоитоценить возможность влияния статуса эозинофилов в бронхах и крови на течение БА у больных с ХГДП, в томчисле, диагностическую и прогностическую ценность генерализации воспалительного пула эозинофилов.Целью настоящей работы явилась комплексная характеристика эозинофильного звена воспаления вовзаимосвязи с клинико-функциональными показателями болезни у больных БА при холод-индуцированном3бронхоспазме.Материалы и методы исследованияПроведено клинико-функциональное обследование 94 больных (средний возраст 39,9±1,2 лет), обоегопола (46 мужчин, 48 женщин) с диагнозом персистирующей БА лёгкого и среднетяжёлого течения, согласнокритериям GINA [12].Клиническое исследование выполнено с учетом требований Хельсинкской декларации «Этическиепринципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов» с поправкой 2013 г.,и нормативных документов «Правила надлежащей клинической практики в Российской Федерации»,утвержденных Приказом №200н от 01.04.2016 МЗ РФ. Все пациенты подписывали информированное согласиена участие в исследовании в соответствии с протоколом, одобренным локальным Комитетом побиомедицинской этике Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания (протокол №120/1от 25.10.17).Уровень контроля астмы, согласно опроснику Asthma Control Test (ACT, Quality Metric Inc., 2002) передначалом исследования составил 17,5±0,6 баллов, объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ 1 ) –95,6±1,8%. Из общего числа обследованных только одна треть больных систематически получала стандартнуютерапию низкими дозами ИГКС (≤500 мкг/сутки по беклометазону дипропионату), у двух третей больныхлечение носило несистематический характер, либо отсутствовало.Дизайном исследования предусматривалось мониторирование клинических симптомов астмы;исследование функции внешнего дыхания с анализом кривой поток–объем форсированного выдоха на аппаратеEasy on-PC (nddMedizintechnik AG, Швейцария) с оценкой динамики ОФВ 1 (ΔОФВ 1БЛ , в %) на введение 4 доз β 2 -агониста (сальбутамол, 100 мг); выявление реакции дыхательных путей (ΔОФВ 1ИГХВ , в %) на холодовой стимулпутём проведения стандартной 3-минутной изокапнической гипервентиляции холодным (-20ºС) воздухом(ИГХВ) [6]. Больным осуществлялся сбор образцов индуцированной мокроты (ИМ) по стандартной методикепод спирометрическим контролем [9], сбор спонтанно продуцируемой мокроты после проведения пробыИГХВ. Цитологическое исследование мокроты выполнялось не позднее 2 часов после её получения постандартной методике, при помощи светооптической иммерсионной микроскопии с подсчётом не менее 400клеток в 100 полях зрения в центральных и периферических частях препарата. Подсчитанное число клетоквыражали в процентах. В утренние часы выполнялся забор периферической крови из пальца с цельюопределения абсолютного (в расчёте на 1 мкл крови) и относительного (при подсчете на 100 клеток, впроцентах) количества эозинофилов.Статистический анализ полученного материала проводился на основе стандартных методоввариационной статистики. Для определения уровня статистической значимости различий использовалипараметрический критерий (t) Стьюдента (парный, непарный), в случаях негауссовых распределений –непараметрический критерий Колмогорова-Смирнова, парный критерий Уилкоксона. С целью определениястепени связи между двумя случайными величинами проводили корреляционный анализ, рассчитываликоэффициент корреляции (r). Для всех величин принимался во внимание минимальный уровень значимости (р)0,05.Результаты исследования и их обсуждениеПо результатам анализа базовых значений клеточного состава ИМ в общей группе больных БАобнаружено повышенное процентное содержание эозинофилов и нейтрофилов (в среднем 9,8±1,07 и48,9±1,53%, соответственно) (рис. 1). Кратковременное воздействие холодового триггера приводило кдостоверному увеличению содержания этих клеток в мокроте (13,3±1,0%, р=0,011; 52,8±1,36%, р=0,022,соответственно). Кроме того, в ответ на пробу ИГХВ наблюдалось значимое усиление цитоза с 2,48±0,25 до3,13±0,32% (р=0,0008).0102030405060нейтрофилыэозинофилымакрофагиисходнопосле пробы ИГХВ%р=0,00001р=0,022р=0,0114Рис. 1. Динамика показателей клеточного состава мокроты до и после пробы ИГХВ в общей группебольных БАДля того чтобы оценить характер клеточных изменений в мокроте у лиц с разными типами реакции нахолодовой стимул, больные были объединены в 1 группу (33 больных) с ХГДП и 2 группу (61 больной) безпризнаков ХГДП (ΔОФВ 1ИГХВ =-18,4±1,3 и -2,2±0,6%, соответственно; р=0,00000001).При анализе исходных цитограмм у больных исследуемых групп прослеживались явления цитоза состатистически достоверным преобладанием его в мокроте пациентов 1 группы по отношению ко 2 группе(3,4±0,68 и 2,1±0,13%, соответственно; р=0,02), в ответ на холодовую бронхопровокацию цитоз значимоувеличивался только у лиц 2 группы (3,3±0,35 и 3,13±0,32%, соответственно; р=0,0002). Со стороныгранулоцитов и в 1, и во 2 группах прослеживались те же тенденции, что и в общей группе больных:воздействие холодного воздуха приводило к росту содержания этих эффекторных клеток в бронхиальномсекрете (рис. 2).нейтрофилыэозинофилы макрофаги01020304050601 группа исходно1 группа после ИГХВ2 группа исходно2 группа после ИГХВр=0,003р=0,031р=0,015р=0,041р=0,024%Рис. 2. Динамика показателей клеточного состава мокроты до и после пробы ИГХВ у больных 1 и 2группы (р – парный критерий Уилкоксона).5Частота 0 8 2 5 1 1 0 3 2 0 1 1 2 0 0 0 0 1 3 1 0 18 ██7 ██6 ██5 █ ██ █4 █ ██ █3 █ █ █ ██ █ █ █2 █ █ █ █ █ █ ██ █ █ █ █ █ █1 █ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █ ██ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █ █----------------------------------------------------------------------------Эоз им 1.20 7.44 13.68 19.92 26.16 32.40Частота 0 23 14 3 1 5 1 1 1 2 2 2 0 1 1 0 1 1 0 0 1 022 █20 █18 █16 █14 █ █12 █ █10 █ █8 █ █6 █ █4 █ █ █2 █ █ █ █ █ █ █----------------------------------------------------------------------------Эоз им 1.00 9.88 18.76 27.64 36.52 45.40Рис. 3. Частота встречаемости эозинофилов в мокроте у больных 1 (верхняя гистограмма) и 2 групп(нижняя гистограмма).Средние значения базового содержания эозинофилов в дыхательных путях, как в общей группе, так ипри разделении пациентов по реакции на пробу ИГХВ, указывали на принадлежность воспалительногопаттерна большинства больных к эозинофильному (≥2% эозинофилов в клеточном составе мокроты) [10].Менее 2% эозинофилов в мокроте присутствовало лишь у 19% больных 1 группы и у 15% больных 2 группы(χ 2 =0,25; р>0,05) (рис. 3), после пробы ИГХВ у этих больных (за исключением 3 больных 1 группы и 4 больных2 группы) наблюдалось увеличение содержания эозинофилов в мокроте более 2%. В обеих группах воздействиехолода приводило также к увеличению в мокроте нейтрофилов при относительном уменьшении числамакрофагов. Увеличение количества гранулоцитов мокроты по окончании пробы ИГХВ рассматривалось намикак свидетельство холод-индуцированной стимуляции локального воспаления в бронхах.Отсутствие статистически достоверных межгрупповых различий в структурном ответе эозинофильного инейтрофильного сегментов инфильтрата бронхов, скорее всего, было вызвано тем, что у 48% больных 1 группыи 66% больных 2 группы (χ 2 =1,95; р>0,05) противовоспалительное лечение носило бессистемный характер,либо отсутствовало, а у больных, получавших терапию, не приводило к адекватной коррекции воспаления ипредполагаемому протективному противовоспалительному эффекту, являясь недостаточным в осуществлениидифференцированного подхода, учитывающего тип бронхиальной гиперреактивности. Эскалацияэозинофильного и нейтрофильного воспаления у пациентов с отсутствием ХГДП, не получавших эффективнуютерапию на этапах, предшествующих исследованию, обусловила фактическое уравнивание воспалительныхстатусов бронхов больных с различными типами реакции дыхательных путей на ИГХВ.По итогам холодовой бронхопровокационной пробы нами не обнаружены отличия в показателяхгранулоцитарного звена воспаления дыхательных путей между пациентами 1 и 2 групп, что не исключаетпоиска этих различий в дальнейшем, при более углублённом исследовании воспалительного профилябронхиального секрета в сочетании с изучением воспалительных реакций крови. Ввиду неконтролируемоготечения астмы, исследуемые больные, в большинстве своём, имели эозинофильный характер воспалениябронхов, в отличие от смешанного, который мы наблюдали у больных тяжелой неконтролируемой БА с ХГДП.Смешанный фенотип характеризуется морфофункциональной активацией нейтрофилов, ассоциируется спрогрессированием симптомов болезни и нарушений вентиляционной функции лёгких [4]. Ранее нами было6показано, что у лиц с высоким содержанием нейтрофилов в мокроте увеличение числа эозинофилов значимовлияло на проходимость дыхательных путей и величину реакции бронхов после ингаляции бронхолитика, чтоприводило к потере контроля БА [3, 5]. Однако сопоставление данных цитограмм с клинико-функциональнымипараметрами в настоящем исследовании выявило некоторую диссоциацию: превалирующий эозинофильныйтип воспаления не был предопределяющим в развитии и приумножении реакции бронхов на ИГХВ, а скореебыл сопряжён с ухудшением клинических и патофизиологических проявлений астмы, ассоциированной сХГДП.Присутствие ХГДП у больных 1 группы, по сравнению со 2 группой, утяжеляло течение болезни, чтохарактеризовалось достоверно более низкими показателями контроля над заболеванием, по данным вопросникаАСТ, более значимыми нарушениями проходимости дистальных бронхов и высоким приростом ОФВ 1 в ответна пробу с бронхолитиком (табл. 1). Как было показано нами ранее, больные БА с ХГДП имеют трудности вдостижении контроля над заболеванием, связанные с неэффективностью проводимой противовоспалительнойтерапии, персистенцией реакции дыхательных путей на холодовое воздействие [13, 18]. Одной из причинможет служить переход бронхиального воспаления с клеточно-органного на системный, организменныйуровень. Для оценки влияния генерализованного воспаления на функциональное состояние дыхательных путейпри неконтролируемом течении легкой БА была предпринята попытка найти взаимосвязь между ХГДП иособенностями клеточного состава периферической крови.Таблица 1Функция внешнего дыхания и уровень контроля заболевания больных БА (М±m)Показатели 1 группа 2 группа рОФВ 1 , % 91,3±2,7 98,0±2,4 0,08ОФВ 1 /ЖЕЛ,% 73,7±1,5 76,6±1,1 0,08МОС 25-75 ,% 66,1±4,0 76,9±3,5 0,035ОФВ 1БЛ , % 16,8±3,7 8,4±1,1 0,006АСТ, баллы 15,6±1,0 18,6±0,8 0,021Примечание: БЛ – изменение показателя в ответ на введение бронхолитика.Существуют научные исследования, в которых доказано, что бронхоконстрикторный эффект находится впрямой зависимости от медиаторной активности эозинофилов. В результате дегрануляции эозинофиловпроисходит экзоцитоз в ткани бронхов синтезированных в эозинофильных гранулах цистеиниловыхлейкотриенов (LTС4, LTD4 и LTE4) [1, 8] и цитотоксичного эозинофильного катионного протеина (ECP),вызывающего деструкцию бронхиального эпителия [10]. Высокая концентрация тучных клеток и эозинофиловв слизистой оболочке дистальных бронхов коррелирует с развитием бронхиальной гиперреактивности [10, 21].Тучные клетки продуцируют и секретируют IL-5, PAF – фактор агрегации тромбоцитов и стимуляции секрециигистамина, LTB4, вызывающий агрегацию и дегрануляцию нейтрофилов, а также активацию лейкоцитов имиграцию нейтрофилов и эозинофилов в очаг воспаления [10]. При этом индуцируется высвобождение ECP,который, в свою очередь, стимулирует тучноклеточный синтез и секрецию гистамина и простагландина D2,являющегося хемоаттрактантом для эозинофилов и Th2 лимфоцитов посредством связывания рецептораCRTH2, регулирует пролиферацию Т- и В-лимфоцитов [10, 17].Найденные нами при исследовании лейкоцитарной формулы периферической крови больных 1 и 2 группсредние показатели относительного количества эозинофилов (табл. 2) свидетельствовали не в пользугенерализации эозинофильного воспаления. Данное обстоятельство с наибольшей вероятностью могло бытьобусловлено лёгким течением болезни у пациентов с ХГДП, сопровождающимся адаптивным ограничениемлокального воспалительного процесса. Что касается абсолютного количества эозинофилов, то, в отличие отпроцентной доли клеток в лейкоцитарной формуле, не имеющей межгрупповых различий, содержаниеэозинофилов в расчёте на один микролитр крови больных с ХГДП было достоверно выше, чем в группе сотсутствием реакции бронхов на ИГХВ (табл. 2).Таблица 2Базовый уровень содержания эозинофилов в периферической крови больных БА (Me [Q1; Q3])Показатель 1 группа 2 группа рЭозинофилы, абсолютное количество в мкл 186,0 [156,0; 224,0] 129,0 [112; 192,0] 0,007Эозинофилы, относительное количество (%) 3,0 [2,0; 3,5] 3,0 [2,0; 4,0] >0,05При сопоставлении клинико-функциональных и лабораторных данных было обнаружено, что значениясуммарного показателя контроля над БА (АСТ, баллы) и базовые фактические величины проходимости мелкихдыхательных путей (МОС 75 ) у исследованных пациентов находились в обратной корреляционной зависимостиот абсолютного количества эозинофилов в периферической крови (r=-0,33; р=0,031 и r=-0,31; р=0,025,соответственно). Генерализация воспалительного процесса, стимулируемая генетически детерминированнымиособенностями иммуногенеза, супрессией иммунной и антиоксидантной защиты, может обусловливать7рефрактерность к проводимой терапии, модулировать инертность снижения клинических проявлений астмы,потенцировать возможность обострений даже при лёгком течении болезни. По некоторым данным, при лёгкойастме тяжёлые обострения случаются в 30-40% случаях и требуют оказания экстренной помощи [11]. ТерапияИГКС уменьшает воспаление бронхов, но оказывает лишь незначительное влияние на структурноеремоделирование, и при прекращении лечения воспаление возвращается [11]. Уровни взаимосвязи междухарактером воспаления, ремоделированием дыхательных путей, критериями контроля и тяжести астмы все ещёдалеки от понимания.Выявление характера воспаления бронхиального секрета и профиля клеточных элементовпериферической крови можно рассматривать не только с точки зрения общих диагностических позиций васпекте прогноза клинического течения БА. По сути, данный подход является фенотип-ориентированным вплане назначения противовоспалительной терапии, принимая во внимание, как особенности клеточнойорганизации бронхиального воспаления, так и показатели системной реакции организма, что позволяетперсонализировать медикаментозную терапию больных БА, в том числе в зависимости от характера реакции нахолодовой стимул.Таким образом, больные с отсутствием контроля БА характеризуются индукцией гранулоцитарногоклеточного воспаления в бронхах под влиянием холодового триггера. Снижение уровня контроля надзаболеванием и функции внешнего дыхания у больных БА с ХГДП ассоциируется с увеличением абсолютногоколичества эозинофилов в периферической крови.