УДК 633.63 : 631.523.11МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ФОРМ   САХАРНОЙ СВЕКЛЫ, ГЕНЕТИЧЕСКИ УСТОЙЧИВЫХ К ФИТОПАТОГЕНАМстарший научный сотрудник Е. Н. Васильченко1доктор биологических наук Т. П. Федулова1кандидат биологических наук Д. Н. Федорин11 – ФГБНУ «Всероссийский научно- исследовательский институт сахарной свеклы  и сахара им. А.Л. Мазлумова»,  посёлок ВНИИСС, Российская Федерация Представлены результаты  по разработке методов проведения генетической трансформации сахарной свеклы (Beta vulgaris L.)  с использованием генетической конструкции  AGLO + pBilt7 с геном mf2  в штамме Agrobacterium tumefaciens.  В качестве донора генов устойчивости  выступает  микробный фактор (MF2), который был выделен из клеточных экстрактов Bacillus thuringiensis. Выделенный фактор (MF2), является термостабильным, низкомолекулярным белком и имеет большую степень гомологии с колд-шок белками  (cold shock proteins, CSP) видов Bacillus и других бактерий. Действие  MF2 заключается в индукции защитных механизмов растения, а не в непосредственном угнетении фитопатогенов. Наилучшим способом трансформации явилось нанесение поранений за 24 часа до кокультивирования, частота регенерации при этом составила в среднем   25.9  %. Оценка первичных трансформантов, предположительно несущих ген mf2,   на селективных средах in vitro с канамицином, показала относительную устойчивость  растений. Проведенная проверка на наличие целевого гена mf2 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) дала возможность отобрать 7 растений, в которых амплифицировался фрагмент ДНК соответствующего размера  (20 п.н.). Сравнительный анализ изоферментного спектра пероксидазы трансформированных растений выявил 5 зон активности, по которым  образцы  различались между собой. Выявленная  высокая активность пероксидазы, играющей ключевую роль при окислительно-восстановительных реакциях, имеет тесную взаимосвязь с защитными реакциями при действии индукторов устойчивости к фитопатогенам. Фитопатологическая оценка отобранных трансформантов сахарной свеклы  в условиях закрытого грунта показала их относительную устойчивость к экзогенному воздействию штаммами грибов Fusarium oxysporum+ Fusarium solani. В результате проведенных исследований  получены трансгенные растения сахарной свеклы, несущие ген MF2, связанные    с   устойчивостью к фитопатогенам, которые  могут найти широкое применение в селекционном процессе.Ключевые слова: сахарная свекла, регенерация,  Agrobacterium tumefaciens, генетическая трансформация, ПЦР- анализ, фитопатогены.  MOLECULAR-GENETIC ASSESSMENT OF SUGAR BEET VARIETIES WHICH GENETICALLY RESISTANT TO PHYTOPATHOGENSSenior Research Officer E. N. Vasilchenko1DSc in Biology T. P. Fedulova1PhD in Biology  D. N. Fedorin11 – Federal State Budgetary Scientific Institution «All-Russian Research Institute of Sugar Beet and Sugar named after A.L. Mazlumova»,  village VNIISS, Russian Federation AbstractThe results of the genetic transformation of sugar beet (Beta vulgaris L.) using the AGLO + pBilt7 genetic construct with the mf2 gene in the Agrobacterium tumefaciens strain are presented. The donor of resistance genes is microbial factor (MF2), which was isolated from Bacillus thuringiensis cell extracts. The selected factor (MF2) is a thermostable, low molecular weight protein and it has a high degree of homology with cold shock proteins (CSP) of Bacillus species and other bacteria. The action of MF2 is to induce the plant defense mechanisms, but not to directly inhibit phytopathogens. The best method of transformation is the application of injuries 24 hours before cocultivation, the frequency of regeneration is on average 25.9 %. Evaluation of primary transformants, presumably carrying the mf2 gene, on selective media with kanamycin in vitro, showed the relative resistance of plants. The test for the presence of the target gene mf2 using the polymerase chain reaction (PCR) made it possible to select 7 plants in which a DNA fragment of the appropriate size was amplified (20 bp). A comparative analysis of the peroxidase isozyme spectrum of transformed plants revealed 5 zones of activity, in which the samples differed among themselves. The revealed high activity of peroxidase, which plays a key role in redox reactions, has a close relationship with protective reactions under the action of inductors of resistance to pathogens. Phytopathological evaluation of sugar beet transformants in greenhouse conditions has showed their relative resistance to the exogenous effects of the fungi Fusarium oxysporum + Fusarium solani. As a result of research, transgenic sugar beet plants with resistance to phytopathogens, which can be widely used in selection, have been created.Keywords: sugar beet, regnaration,  Agrobacterium tumefaciens, genetic transformation, PCR analysis, phytopathogens  Молекулярные взаимодействия, приводящие к активации защитных механизмов растения, интенсивно изучаются, и последние достижения открывают возможности для повышения устойчивости сельскохозяйственных  и лесных древесных растений к грибным и бактериальным болезням методами генетической инженерии.Cоздание сортов и гибридов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) с повышенной устойчивостью к различным стрессовым факторам внешней среды является одной  из важных и перспективных проблем в селекции  [8]. Сахарную свеклу поражают различные болезни, что приводит к значительному снижению урожая и ухудшению качества сырья. Так, от корневых гнилей за вегетационный период с каждого гектара теряется до 7,5 и более тонн корнеплодов.  Высокая стоимость обработок посевов и экологические нарушения, вызванные применением химических средств защиты растений, заставляют искать новые пути решения данной проблемы [9].  В связи с этим, большое значение приобретает селекция на повышение устойчивости растений к болезням. Использование методов генной инженерии, предусматривающей передачу в растения целевых генов и их экспрессию, способствует решению данной проблемы [1, 2].   При создании трансгенных растений в качестве донора генов устойчивости могут выступать не только близкородственные растения, как в классической селекции, но и организмы, отстоящие далеко от данного растения в плане генетического родства, такие как бактерии, грибы и многие другие [3, 7].   Одним из них является микробный фактор (MF2), который был выделен из клеточных экстрактов Bacillus thuringiensis. Выделенный фактор (MF2), является термостабильным, низкомолекулярным белком и имеет большую степень гомологии с колд-шок белками  (cold shock proteins, CSP) видов Bacillus и других бактерий. Действие  MF2 заключается в индукции защитных механизмов растения, а не в непосредственном угнетении фитопатогенов [6].   Использование генов, кодирующих белки, способных индуцировать неспецифическую устойчивость растения к вирусным и грибным фитопатогенам, может способствовать созданию сортов и гибридов, обладающих устойчивостью к широкому спектру фитопатогенов. В связи с этим разработка методов создания трансгенных растений сахарной свеклы с устойчивостью к биотическим стрессовым факторам является в настоящее время актуальным направлением исследований.Для  создания трансгенных растений сахарной свеклы, устойчивых к широкому спектру фитопатогенов, использовали генетическую конструкцию с бактериальным геном mf2 в штамме Agrobacterium tumefaciens, которую  любезно предоставил к.б.н. Джавахия В.Г. (лаборатория молекулярной биологии ВНИИФ, Голицино, Московская обл.) [5]В качестве материалов для исследований были  использованы растения мужскостерильных форм и фертильные линии сахарной свеклы  селекции ВНИИСС. В качестве реципиентной ткани использовали  черешки и ткани из области семядольных узлов, содержащих меристематические клетки, компетентные к прямой регенерации побегов in vitro.Проверку предполагаемых трансгенных растений сахарной свеклы  на наличие целевого гена mf2 проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в присутствии праймеров  (5/- atg caa aca ggt aaa gtt - 3/  и  5/- agt ttt ttg taa cgt tag cag c - 3/ ),   синтезированных  в ЗАО «Синтол» (г. Москва).В результате проведенных экспериментальных  исследований установлено, что независимо от генотипа наилучшей регенерационной способностью обладают экспланты из области семядольных узлов (переходная зона между черешком семядоли и гипокотилем), чем экспланты из основания побегов черешков. В среднем частота регенерации в первом случае составила 27,9 %, а во втором 14,0 %. При этом область семядольных узлов формировала не один, а множество придаточных побегов, в то время как экспланты из основания черешков формировали 1,2 побега на эксплант [4].   Дальнейшая инкубация полученных  эксплантов при температуре на 3-50С выше (т.е. 300С) в темновых условиях приводила к увеличению выхода регенерантов. Частота регенерации составила в среднем у переходной зоны 34,8 %, а у черешков листьев 27,4%.По результатам исследований выявлено, что лучшим способом трансформации оказалось нанесение поранений за 24 часа до кокультивирования эксплантов. При этом частота регенерации составила в среднем 25,9%, против 13,9 % при поранении непосредственно перед кокультивированием (табл. 1).Наши эксперименты показали, что однократное погружение эксплантов в суспензию агробактерий с последующим культивированием на агаризованной среде является более «щадящим», чем кокультивирование эксплантов в жидкой среде с добавлением агробактерий. В первом случае количество регенерирующих эксплантов составило 51,1 %, а во втором 22,1 %.Таким образом, передача целевого  гена  mf2, осуществленная на сахарной свекле путем прямой регенерации, дала возможность отобрать 8 первичных регенерантов с геном mf2, обладающих устойчивостью к селективному агенту – канамицину [10].  Молекулярно-генетическая оценка предполагаемых трансгенных растений сахарной свеклы  на наличие целевого гена,  с использованием специфических праймеров,  позволила отобрать 7 растений с геном mf2. В данных растениях выявлен  ДНК-ампликон соответствующего размера (20 п.н.) (рис.1).Результаты проведенного молекулярно-генетического анализа показали интеграцию целевого гена mf2 в геном  растений – реципиентов № 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 и отсутствие данного гена в растении № 4. ПЦР-анализ растений сахарной свеклы с использованием произвольных RAPD-праймеров   РАW6, РАW16, РАW17 показал значительные отличия опытных растений по сравнению с контролем в виде характерных  дополнительных ампликонов в изученных растениях.   Таблица 1Влияние типа экспланта  на регенерационную способность.Поранение нанесено непосредственноперед кокультивированиемПоранение нанесено за 24 часа до кокультивированиятип эксплантакол-во посажен.кол-во регенерантовтип эксплантакол-во посажен.кол-во регенерантов эксплан.шт.% эксплан.шт.%черешок2943913,4черешок2105123,7Переходная зона1832614,4Переходная зона1574428,1среднее13,9среднее25,9  Рис. 1. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов растений сахарной свеклы1- ДНК нетрансформированного растения (контроль); М – маркеры молекулярных масс;2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 – ДНК трансформированных растений, несущих ген mf2; 4 – ДНК трансформированного растения, не несущего ген mf2;10 – контрольная ДНК агробактерии AGLO + pBilt5 Выявленные генетические  изменения в растениях сахарной свеклы указывают на разнородность полученного материала,  обусловленного различной интеграцией гена  mf2 в геном сахарной свеклы. Также был исследован уровень полиморфизма микросателлитных локусов трансгенных растений сахарной свеклы с геном mf2. Высокий полиморфизм обнаружили локусы, амплифицированные с SSR-праймерами Bvv21/Bvv53: по четыре  ДНК-ампликона выявлено у образцов под номерами 1, 3 и у контрольного растения, три ДНК-фрагмента – у образца №4, парные полосы идентифицированы у линии под номером 2.Амплификация с SSR-праймерами Bvv43/Bvv15 показала наличие парных, но не идентичных ДНК-фрагментов у линий 1, 3, 4 и у контрольного образца. Линия №2  имела один фрагмент.Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что не все микросателлитные локусы одинаково эффективны для исследования генома трансгенных форм сахарной свеклы, так как могут проявлять незначительный полиморфизм или являться мономорфными. Однако, следует отметить, что при совокупном анализе нескольких локусов получены уникальные микросателлитные профили с набором фрагментов, специфичных для каждой линии. Это стало основой для составления индивидуальных генетических паспортов. Для более надежной и  точной идентификации различий между созданными ГМ растениями сахарной свеклы планируется проведение более глубоких молекулярных исследований на генетическом анализаторе с использованием SNP-маркеров. Это позволит определить точечные измененения в геноме полученных трансгенных форм. Биохимический анализ отобранных растений-трансформантов выявил повышение в 2-2,5 раза активности фермента пероксидазы, играющего ключевую роль при окислительно-восстановительных реакциях, тесно взаимосвязанных с защитными свойствами организма (рис.2).      Рис. 2. Общая активность пероксидазы микроклонов сахарной свеклык1-к3- контрольный образец,  № 1 - №4 – трансгенные образцы, несущие ген mf2 По результатам биохимических исследований выявлено изменение изоферментного спектра пероксидазы у трансгеных растений. Это позволило предположить, что повышение активности пероксидазы и отличие в изоферментном спектре у созданных растений, возможно, вызваны внедрением чужеродных генов и могут отражать устойчивость растений (рис.3).  Рис. 3. Изоферментный спектр пероксидазы микроклонов сахарной свеклык – контрольный образец; 1-4 – трансгенные образцы, несущие ген mf2 (Стрелками выделены зоны различий) У отобранных генетически модифицированных растений показано также повышение активности дегидрогеназ глиоксилатного и лимонного циклов, отражающих стрессовое состояние энергетического метаболизма при встраивании целевых генов.У трансгенных растений отмечено повышение  более чем в 2 раза активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы. Данный фермент  участвует обычно в синтезе и утилизации в клетках лигнина при разнообразных защитных реакциях организма (рис.4). Результаты проведенных исследований показывают, что повышение активности данного фермента свидетельствует о повышении свойства неспецифической устойчивости трансгенных растений по сравнению с контрольными формами.Дальнейшая фитопатологическая оценка регенерантов сахарной свеклы в условиях закрытого грунта при обработке споровой суспензией Fusarium solani + Fusarium oxysporium выявила замедление роста и развития в 2-2,5 раза только в контрольном варианте. У растений происходило отмирание листового аппарата, хлороз и скручивание листьев, появление некротических пятен. Наблюдалось утолщение и шелушение кожицы  корнеплода и образование на ее поверхности различных  наростов. Сосудистая система оставалась не пораженной, как у опытных, так и у контрольных образцов  (рис. 5).     Рис. 4 Общая активность фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы,микроклонов сахарной свеклы, несущих ген mf2№1-№3 –трансгенные образцы  Рис.5 Обработка  трансгенных растений сахарной свеклы (штаммами грибов Fusarium solani + Fusarium oxysporium) У опытных образцов морфологических изменений в формировании листового аппарата не выявлено. При обработке  культуральной жидкостью данных грибов растений-трансформантов и контрольных образцов отмечена  потеря тургора у контрольных растений и полное увядание на третьи сутки. Это подтверждает относительную устойчивость трансформантов к экзогенному воздействию грибов.Таким образом, в результате проведенных биотехнологических и молекулярно-генетических исследования разработан оригинальный метод генетической  трансформации сахарной    свеклы с   геном mf2  в штамме Agrobacterium tumefaciens и созданы трансгенные растения сахарной свеклы с   устойчивостью к фитопатогенам. Данные растения могут найти широкое применение в качестве нового исходного материала при селекции на устойчивость к болезням.Разработанные нами научно-методические и молекулярно-биологические приёмы могут быть использованы не только на сахарной свёкле, но и на лесных древесных культурах при создании форм растений, генетически устойчивых к биотическим факторам. Расширение данных исследований с вовлечением новых видов растений, в том числе древесных в промышленном масштабе потребует строгого следования определённым критериям, таким как эффективность, надёжность, отсутствие токсичности и слабое воздействие на окружающую среду.