Введение. Продовольственная безопасность является ключевым компонентом устойчивого развития Российской Федерации, в связи с чем увеличение продуктивности растениеводства и повышение качества продукции остаются приоритетными задачами сельскохозяйственной биологии. Химические пестициды, обеспечившие значительный рост производительности в XX веке, имеют серьезные недостатки: накопление в продуктах питания и окружающей среде, прямой вред здоровью при применении [1, 2]. Тем не менее полный отказ от химических средств защиты может привести к дефициту продуктов питания, поэтому поиск безопасных альтернатив актуален.Биологические препараты на основе непатогенных микроорганизмов представляют собой перспективную альтернативу химическим пестицидам [1, 2]. Конкурируя с патогенами, полезные микроорганизмы подавляют развитие заболеваний растений [3, 4]. Биологические средства защиты безопасны для окружающей среды, их метаболиты не накапливаются в конечной продукции растениеводства [5]. Однако многие биопрепараты менее эффективны, чем химические пестициды, особенно в полевых условиях. Меняющиеся условия окружающей среды оказывают значительное влияние на активность полезных микроорганизмов, что снижает эффективность биологических препаратов [6, 7].Одним из способов повышения эффективности биопрепаратов является их комбинирование с биостимуляторами [8] или химическими пестицидами [9]. Наметившийся в последнее время интерес к созданию консорциумов или сочетанию биопестицидов, направлен на увеличение эффективности биологических средств защиты растений. При сочетании отдельных штаммов или совместном применении биопрепаратов на их основе необходимо учитывать совместимость агентов биологической защиты, поскольку многие микроорганизмы защищают растения путем вытеснения других колонизаторов, включая фитопатогены [10, 11]. Исследования показывают, что применение смеси Trichoderma gamsii и Pseudomonas azotoformans обеспечивало стабильную супрессию фузариоза пшеницы [12].В России биопрепараты на основе штаммов Pseudomonas и Trichoderma широко применяются в тепличных хозяйствах. Штамм Pseudomonas putida PCL1760, выделенный из ризосферы авокадо, проявляет биозащитные свойства против корневых патогенов [13]. Штамм Trichoderma asperellum Т302, выделенный из погребенных почв [14], по нашим данным также демонстрирует антагонистическую активность против фитопатогенов.Целью настоящей работы явилась оценка совместимости агентов биологической защиты растений Pseudomonas putida PCL1760 и Trichoderma asperellum Т302 при совместном применении в условиях in vitro, в гнотобиотической системе и при биологическом контроле фузариозной корневой гнили томатов, вызванной штаммом Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici ZUM2407.Условия, материалы и методы.Использованные в работе штаммы приведены в таблице 1.Таблица 1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работеШтаммОписаниеИсточник, ссылкаPseudomonas putida PCL1760Агент биологической защиты растений, активный колонизатор корней растений, действующий посредством механизма конкурентной колонизации, выделен с корней авокадоДепонирован в ВКПМ под как Pseudomonas plecoglossicida B-13802 [13,15]Pseudomonas aureofaciens 30-84Агент биологической защиты растений, продуцент антибиотиков окси-феназинов[16]Trichoderma asperellum Т302Выделен из почвы Мурзихинского II могильника (Республика Татарстан, Россия), продуцент вторичных метаболитовДепонирован в ВКПМ под как Trichoderma asperellum F‑1087 [14]Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici ZUM2407Модельный фитопатоген, вызывающий корневые гнили томатов[17] Для культивирования штаммов использовали среду LB (триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 10 г/л, агар 20 г/л). Штаммы грибов поддерживали на среде Чапека следующего состава: сахароза 30 г/л, NaNO₃ 2 г/л, K₂HPO₄ 1 г/л, MgSO₄·7H₂O 0,5 г/л, KCl 0,5 г/л, FeSO₄·7H₂O 0,01 г/л, CaCO₃ 3 г/л, агар 20 г/л). Семена томатов сорта Белый налив 241 (ООО «НПО «ГАВРИШ», Москва, Россия) использовались для экспериментов по колонизации и биологической защите.Определение антагонистической активности. Штаммы высевали на среду LB или Чапека. Для оценки влияния бактериальных метаболитов на развитие гриба агар с мицелием штамма Т302 выкладывали в центр чашки Петри, бактерии высевали на расстоянии 2-3 см от центра. Для оценки влияния грибных метаболитов супернатант штамма Т302 (после 96 ч культивации в LB-бульоне) помещали в лунку на газоне PCL1760. Результаты фиксировали после 48 – 96 ч инкубации при 28°C.Метаболическое профилирование. Для тестов использовали микропланшеты Biolog FF и GENIII (Biolog Inc., США) с 95 источниками углерода. При определении влияния метаболитов штамма P. putida PCL1760 на рост штамма T. asperellum Т302 50 мкл культуральной жидкости ночной культуры штамма PCL1760, стерилизованной фильтрацией через нейлоновый фильтр 0,22 мкм (), добавляли в лунки планшета FF, после чего в лунки добавляли 105 спор штамма Т302. При тестировании влияния метаболитов штамма T. asperellum Т302 на рост штамма P. putida PCL1760 50 мкл культуральной жидкости 72-часовой культуры штамма Т302, стерилизованной фильтрацией через нейлоновый фильтр 0,22 мкм, добавляли в лунки планшета GENIII, после чего в лунки добавляли 10 мкл культуры PCL1760 с оптической плотностью ОП600=0,1. В контрольных вариантах инокуляцию спор штамма T. asperellum Т302 и культуры P. putida PCL1760 проводили в планшеты FF и GENIII, соответственно с добавлением 50 мкл фосфатно-солевого буфера (ООО «Компания Хеликон, Москва, Россия). Все планшеты инкубировали при 28°C; оптическую плотность измеряли при 490 и 750 нм каждые 24 ч с помощью Biolog MicroStation (Biolog Inc., США). В соответствии с рекомендациями производителя микропланшет считали положительным при OD₄₉₀ выше 0,4. Стимуляцией считали рост культуры обеспечивающий наличие как минимум двух лунок с оптической плотностью OD₄₉₀>0,4 [18].Конкурентная колонизация корней. Семена томатов стерилизовали в 70% этаноле (5 мин), затем в 1% растворе гипохлорита натрия с 0,1% додецилсульфата натрия (15 мин), промывали стерильной водой в течение 1 ч, после чего семена выкладывали на поверхность агара, приготовленного на основе питательного растительного раствора (ПРР) как описано в работе [19]. Стерильные проклюнувшиеся семена (длина корешка <5 мм) инокулировали суспензией спор штамма Т302 или/и клеток штамма PCL1760, высевали в стерильные трубки с песком, смоченным (ПРР). Растения выращивали при 21-24°C с 16-часовым световым днем в течение 7 суток. Численность PCL1760 на 1 см кончика корня определяли высевом на агар и подсчетом колоний.Определение количества T. asperellum Т302 в корнях томатов.Корни томатов извлекали из песка после выращивания в гнотобиотической системе, отделяли от верхней части растений и перемалывали в жидком азоте. Всего были анализированы по 15 растений из каждого варианта обработки (PCL1760, Т302, PCL1760+Т302), каждый вариант был поделен на группы по 5 растений (корней). Далее ДНК из корней выделяли ранее описанным методом [20]. Для детекции ДНК T. asperellum Т302 использовали праймеры специфичные к b-актину грибов ACT-512F 5’-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3’ и ACT-783R 5’-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT--3’ [21] и смесь для количественного ПЦР 5X qPCRmix-HS SYBR (ЗАО Евроген, Москва, Россия). Реакционная смесь включала 4 мкл смеси 5X qPCRmix-HS SYBR, 100 нг тотальной ДНК, выделенной из корней томатов, 0,1 pM каждого из праймеров ACT-512F и ACT-783R. До объема 20 мкл смесь доводили деионизованной водой (ЗАО Евроген, Москва, Россия). Реакцию амплификации проводили в термостате ДТ-96 (ДНК-технологии, Москва, Россия) в следующем температурном режиме: после 3 минут денатурации при 95°C следовали 40 циклов 95°С – 20 сек. и 61°С – 20 сек., измерение флюоресценции SYBR green проводили сразу после этапа отжига, до денатурации. Кривая плавления строилась в интервале температур от 60°C до 95°C после окончания всей программы амплификации.Калибровочную кривую строили на основе ДНК штамма T. asperellum Т302 разведенной ДНК, выделенной из стерильных растений томата. Для этого в препарат ДНК томата (100 нг/мкл) добавляли ДНК T. asperellum Т302 до концентрации 10 нг/мкл, 1 нг/мкл, 100 пг/мкл, 10 пг/мкл, 1 пг/мкл, 100 фг/мкл, 10 фг/мкл и 1 фг/мкл.Биологическая защита томатов. Семена томатов обрабатывали 1% раствором карбоксиметилцеллюлозы с бактериями (108 КОЕ/мл) и/или спорами Т302. Споры Forl ZUM2407 вносили в почву в концентрации2×10⁶ спор/кг. Растения выращивали в теплице при 21-24°C, 70% влажности и 16-часовом дне. Через 21-25 дней растения извлекали из почвы и оценивали симптомы корневой гнили: коричневые пятна и поражение тканей корней и подсемядольного колена. Для каждого варианта обработки использовали по 100 растений, которые делились на группы по 10 растений, для которых высчитывали общий индекс поражения как это сделано в работе [21]. Статистическую обработку данных производили с 10 группами каждого варианта обработки.Статистический анализ проводили с помощью ANOVA и теста Фишера (α=0,05) в программном пакете SPSS (США).Результаты и обсуждение.Антагонистическая активность in vitro. При конфронтационном тестировании штамм P. aureofaciens 30-84 (положительный контроль) выделял оксифеназины (оранжевая окраска колоний) и формировал зону ингибирования роста T. asperellum Т302 (рис. 1А). Мицелий Т302 около колонии PCL1760 не изменялся, что свидетельствует об отсутствии токсичных веществ в экзопродуктах PCL1760. Метаболиты Т302 также не были токсичны для PCL1760 — вокруг лунки с супернатантом Т302 не наблюдалось ингибирования роста бактериальной культуры (рисунок 1Б). Результаты показывают отсутствие взаимного антагонизма между штаммами PCL1760 и Т302 in vitro.  А БРисунок 1 – Тестирование антагонистической активности штаммов in vitro: А – влияние бактериальных метаболитов P. aureofaciens 30-84 и P. putida PCL1760 на рост T. asperellum Т302 (стрелка указывает зону ингибирования), Б – влияние супернатанта Т302 на рост PCL1760 Данные результаты подтверждают отсутствие каких-либо токсичных для T. asperellum Т302 метаболитов, продуцируемых штаммом PCL1760. При анализе генома этого штамма также не было обнаружено генетических систем, которые могут направлять синтез токсичных для грибов вторичных метаболитов [15].Влияние метаболитов на потребление субстратов. Добавление культуральной жидкости PCL1760 не оказывало влияния на рост T. asperellum Т302. Не отмечалось изменений в потреблении субстратов или замедления роста культуры Т302, что подтверждает отсутствие токсичных метаболитов штамма PCL1760.Несмотря на то, что штамм T. asperellum Т302 выделяет некоторые антагонистические вещества [14], при добавлении культуральной жидкости Т302 в среды с PCL1760 ингибирующее влияние также не обнаружено. При использовании неразбавленной культуральной жидкости Т302 наблюдалась стимуляция роста PCL1760, что объясняется присутствием неиспользованных питательных веществ в среде культивирования микромицета. При разбавлении культуральной жидкости в 10 и более раз стимулирующий эффект исчезал. Эксперимент показал, что штаммы PCL1760 и Т302 не производят взаимно токсичных веществ и не стимулируют рост друг друга при нормальных концентрациях.Конкурентная колонизация корней томатов. В гнотобиотической системе численность штамма PCL1760 на кончике корня при моноинокуляции достигала 1,4×10⁶ клеток на 1 см корня. При совместной инокуляции с Т302 численность PCL1760 увеличивалась до 11,5×10⁶ клеток, т.е. в 8,2 раза (рис. 2). Поскольку штаммы не влияли друг на друга in vitro, наблюдаемое увеличение численности PCL1760 может быть результатом опосредованного влияния штамма триходермы через изменение выделения корневых экссудатов, что может способствовать росту бактерий-колонизаторов. Рисунок 2 – Численность штамма P. putida PCL1760 на апикальной части корня томатов при одиночной и совместной инокуляции с T. asperellum Т302. Планки погрешностей отображают стандартное отклонение.Количество ДНК Т302, получаемое из растений, инокулированных смесью штаммов и только Т302, значимо не отличалось (рис. 3), что свидетельствует об отсутствии влияния PCL1760 на эффективность колонизации корней томатов T.asperellum Т302. Таким образом, совместная инокуляция не влияла на колонизацию томатов штаммом Т302. Рисунок 3 – Количество ДНК штамма T. asperellum Т302 на корнях томатов при одиночной и совместной инокуляции с P. putida PCL1760 Ненулевые значения концентрации ДНК T. asperellum Т302, появляющиеся в контроле и варианте, инокулированном только штаммом P. putida PCL1760, вероятно возникают из-за фоновой амплификации или возникновении димеров праймеров, которые также являются двухцепочечной ДНК, в которую интеркалируется краситель SYBR green.На основании проведенного опыта можно предположить, что штаммы P. putida PCL1760 и T. asperellum Т302 не конкурируют при колонизации корней растений томата.Влияние инокуляции штаммами P. putida PCL1760 и T. asperellum Т302 на развитие растений томата.Штамм P. putida PCL1760 выделен как активный колонизатор, однако он не способен стимулировать рост растений [22]. Для штамма T. asperellum Т302 также не описан эффект стимуляции роста растений. Тем не менее инокуляция растений томата в гнотобиотической системе показала небольшое увеличение надземной части растений. При этом контроль и остальные варианты статистически значимо не отличались друг от друга (рис. 4). Рисунок 4 – Масса надземной части растений томатов при различных вариантах обработки после выращивания в гнотобиотической системе. Биологический контроль корневой гнили томатов.Штамм P. putida PCL1760 является агентом биологической защиты растений, действующим посредством механизма конкурентной колонизации [13]. Несмотря на отсутствие токсичных для грибов вторичных метаболитов, выделяемых литических ферментов и неспособностью к индукции системной устойчивости растений, штамм P. putida PCL1760 является эффективным агентом биологической защиты томатов [23]. Штаммы Trichoderma sp. также являются хорошими колонизаторами, однако они уступают псевдомонадам в скорости колонизации, поскольку распространяются по корню растения-хозяина за счет пролиферации гиф, а не благодаря расселению отдельных подвижных клеток [24]. Как правило, биозащитные штаммы триходерм действуют с помощью механизма паразитизма и хищничества [25, 26]. Полученные нами результаты доказывают, что штамм T. asperellum Т302, несмотря на то что он выделен из погребенных земель [14] также является эффективным агентом биологической защиты растений, который способен значительно подавлять развитие фузариозной корневой гнили на томатах (рис. 5).Различия между вариантами PCL1760, Т302 и PCL1760+Т302 были статистически незначимы, что говорит об отсутствии интерференции между штаммами P. putida PCL1760 и T. asperellum Т302 при защите растений от атаки фитопатогенного Forl ZUM2407. Следует также отметить, что штамм PCL1760 при одиночной инокуляции показал наибольшую эффективность защиты (рис. 5). Рисунок 5 – Индекс поражения томатов корневой гнилью при различных вариантах обработки (разными буквами латинского алфавита обозначены статистически достоверно отличающиеся варианты (p<0,05) В приведенной формуле подсчета индекса поражения (ИП) n0, n1, n2, n3 и n4 представляют количества растений без поражений и с поражениями уровня 1, 2, 3, 4, соответственно [20].Результаты согласуются с данными о том, что штамм PCL1760 проявляет биозащитный эффект путем конкуренции с фитопатогенами за экологические ниши [13]. Штаммы триходерм могут подавлять фитопатогенные грибы за счет механизмов хищничества и паразитизма [24, 25, 26, 27]. При совместной инокуляции конкуренция между штаммами, по-видимому, отсутствует в виду использования разных механизмов защиты растений, что делает их совместимыми агентами биологической защиты.Полученные данные имеют практическое значение для тепличного овощеводства где оба этих штамма могут быть использованы. Штаммы PCL1760 и Т302 проходили полупромышленные испытания в тепличных хозяйствах [20, 26], и подтверждение их совместимости расширяет возможности создания комплексных биопрепаратов для защиты томатов от корневых гнилей.Выводы. Штаммы P. putida PCL1760 и T. asperellum Т302 не выделяют токсичных друг для друга метаболитов в условиях in vitro, при этом, возможно, метаболиты штамма T. asperellum Т302 оказывают стимулирующий эффект на потребление субстратов штаммом P. putida PCL1760, тогда как метаболиты PCL1760 не влияют на метаболический профиль Т302.Совместная инокуляция проростков томата не приводит к значимому снижению колонизации штаммом T. asperellum Т302. При этом наблюдалось увеличение численности клеток штамма PCL1760 в 8,2 раза при совместной инокуляции с штаммом триходермы.Штамм P. putida PCL1760, так же, как и штамм T. asperellum Т302 снижали индекс заболевания с 0,68 до 0,13 и 0,26, соответственно. Совместное применение этих двух штаммов также показало эффективную биологическую защиту томатов от корневых гнилей, вызванных Forl ZUM2407, снижая индекс заболевания до 0,23.Из полученных результатов можно сделать вывод о совместимости штаммов P. putida PCL1760 и T. asperellum Т302 в комплексных биопрепаратах для защиты томатов от фузариозных корневых гнилей.