Цель исследования – изучение видового разнообразия нематод рода Setaria, особенностей их распространения среди животных Узбекистана и морфолого-генетические подходы к их дифференциации. Материалы и методы. Методом световой микроскопии исследованы зрелые стадии нематод рода Setaria от лошадей и крупного рогатого скота. Морфологические и молекулярно-генетические исследования видов S. equina и S. labiatopapillosa проводили общепринятыми методами. Результаты и обсуждение. У млекопитающих Узбекистана установлено 5 видов сетарий, которые локализовались в брюшной полости. Морфологические признаки исследуемых видов (S. equina и S. labiatopapillosa) весьма сходны, пределы изменчивости морфометрических признаков, практически, перекрещиваются за исключением размеров спикул. Наиболее надежными методами дифференциации исследуемых видов являются молекулярно-генетические.
Setaria, нематоды, молекулярная биология, рДНК, ITS, Узбекистан.
Нематоды, несомненно, являются одними из наиболее популярных объектов исследований, прежде всего, как паразитов животных, человека и растений. В этом отношении, особого внимания заслуживают нематоды рода SetariaViborg, 1795. Представители этого рода характеризуются широким распространением и адаптацией к паразитированию у широкого круга животных – хозяев. Они зарегистрированы у различных видов непарно- и парнокопытных, а также мозоленогих Узбекистана [9]. Сетарии, являясь эндопаразитами брюшной полости, вызывают значительное снижение продуктивности сельскохозяйственных и промысловых животных. Видовое разнообразие, патогенность сетарий, особенности их экологии изучены слабо (Осипов, 1966). Более того, вопрос о видовом составе рода Setaria и их локализации довольно спорный и точки зрения различных авторов противоречивы [8].
Материалы и методы
Cетарий собирали из брюшной полости представителей Equidae, Suidae, Bovidaeи Cervidaeфауны из всех регионов Узбекистана. Всего исследовано 1550 экз. млекопитающих во все сезоны года.
В местах концентрации животных собрано и исследовано около 25 тыс. экз. кровососущих двукрылых из различных зон (весной, летом и осенью) с целью выявления инвазированности их личинками сетарий. Сбор и исследование проводили общепринятыми методами [1, 2]. Морфологическое изучение зрелых сетарий проводилось по работам исследователей [8, 10].
Для молекулярно-генетических исследований использованы сборы сетарий от лошадей и крупного рогатого скота из хозяйств Ташкентской области. Было исследовано 5 экз. самцов S. equinaот лошадей и 5 экз. S.labiatopapillosa от крупного рогатого скота. Образцы нематод хранили в 70%-ном этаноле.
Отдельно у каждой нематоды выделяли ДНК с использованием набора DNATissuekit (Macherey-Nagel, Germany). Растворенную в буфере ДНК хранили при – 20 °С.Фрагменты (ITS-1+5,8S+ITS-2) рибосомальной ДНК были получены в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров 18Sd6 и 28Sr3. ПЦР проводили по следующей схеме: 1 этап – денатурация ДНК при 95 °С в течение 3 мин, 2 этап – денатурация ДНК при 93 °С – 20 с, 3 этап – отжиг праймеров при 55 °С – 30 с, 4 этап – элонгация цепи при 72 °С – 2 мин, 5 этап – элонгация цепи при 72 °С – 10 мин. Этапы со 2 по 4 повторяли циклически 35 раз. ПЦР-продукты были очищены от примесей с использованием гель-электрофореза и служили для определения нуклеотидных последовательностей по методу Сэнгера. Секвенирование ДНК проведено в центре коллективного использования «Геном» с помощью набора реактивов ABIPRISM®BigDye™ Terminatorv. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе АВIPRISM 3100-Avant (AppliedBiosystems).
Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с использованием пакета компьютерных программ MEGA5, выравнивание и сравнение сиквенсов – с использованием метода Bioedit и ClustalW.
Статистическую обработку морфометрических данных осуществляли с помощью компьютерной программы Biostat 2007 и MicrosoftOfficeExcel 2003.
Результаты и обсуждение
Нами установлено, что род Setariaв биогеценозах Узбекистана представлен 5 видами: S. equina (Abildgaard, 1789), S. bernardiRaillietetHenry, 1911, S. digitata(Linstow, 1906), S. cervi (Rudolphi, 1819), S. labiatopapillosa (Alessandrini, 1848), которые являются паразитами животных отрядов непарно- и парнокопытных, а также мозоленогих. Обнаруженные сетарии распределены среди окончательных хозяев следующих семейств: у Equidae(лошадь, осел) зарегистрировано только S. equina, зараженность которых составила 25,5–40,0 %; S. bernardi– у Suidae(свинья) при экстенсивности инвазии 0,5–3,0 %; S. digitata– у Bovidae(крупный рогатый скот и коза), экстенсивность инвазии 1,0–5,0 %; S. cervi– у CervidaeI (бухарский олень и косуля) при инвазированности 1,0–5,0 % и S. labiatopapillosaу Bovidae(крупный рогатый скот, овца, коза) и Camelidae(верблюд) при общей зараженности 2,0–35,5 %. Интенсивность инвазии у исследованных животных составила от 1 до 62 экз. Отмеченные виды сетарий распространены во всех регионах Узбекистана.
К доминирующим видам сетарий следует отнести S. equinaи S. labiatopapillosa.В жизненных циклах этих видов сетарий, как показали результаты наших исследований, участвуют кровососущие двукрылые: Culexpipiensи Anophelesmaculipennisдля S. equina.Естественная зараженность их составляет от 0,3 до 1,2 %. Личинки S. labiatopapillosaотмечены у Stomoxyscalcitrans(0,9 %) и Aedescaspius(0,3 %).
Инвазионные личинки указанных видов сетарий зарегистрированы у кровососущих двукрылых в теплое время года (май–сентябрь). Можно полагать, что лошади и крупный рогатый скот заражаются сетариями весной, летом и в начале осени, т. е. до наступления холодов.
Основные морфометрические признаки исследуемых видов сетарий приведены в таблице.
Морфологическое сходство рассматриваемых видов сетарий очевидно, что соответствует многочисленным данным литературы [8, 10].
При сравнении морфологических параметров самцов и самок S. equinaи S. labiatopapillosa признаки размерного характера оказались непригодными для различия этих видов в связи тем, что пределы изменчивости указанных видов перекрещиваются за исключением размеров спикулы и расположения сосочков.
Таблица 1.
Сравнительная характеристика нематод Setaria equina и S. labiatopapillosa, мм
|
Признак |
S. equina |
S. labiatopapillosa |
||
|
лимит |
M±m |
лимит |
M±m |
|
|
С а м ц ы |
||||
|
Длина тела |
58–73 |
65,5±1,5 |
42–53 |
46,5±0,96 |
|
Ширина тела |
0,48–0,58 |
0,53±0,01 |
0,38–0,46 |
0,42±0,01 |
|
Длина пищевода |
6–8 |
7±0,21 |
7,5–8,5 |
8±0,30 |
|
передней части |
0,52–0,56 |
0,54±0,004 |
0,6–0,8 |
0,7±0,02 |
|
задней части |
5,4–7,5 |
6,45±0,24 |
7,0–8,5 |
7,7±0,30 |
|
Длина хвоста |
0,11–0,13 |
0,12±0,002 |
0,16–0,20 |
0,17±0,04 |
|
Длина правой спикулы |
0,28–0,30 |
0,24±0,002 |
0,12–0,16 |
0,14±0,04 |
|
Длина левой спикулы |
0,62–0,66 |
0,64±0,004 |
0,26–0,28 |
0,27±0,002 |
|
Число сосочков |
8 пар |
8 пар |
||
|
С а м к и |
||||
|
Длина тела |
110–190 |
150±9,86 |
62,0–94,0 |
79,1±3,88 |
|
Ширина тела |
1,0–1,4 |
1,23±0,04 |
0,6–0,9 |
0,72±0,03 |
|
Длина пищевода |
12,0–13,0 |
12,4±0,10 |
8,0–11,0 |
9,4±0,31 |
|
передней части |
0,8–1,2 |
0,97±0,04 |
0,6–0,8 |
0,7±0,02 |
|
задней части |
11,0–12,0 |
11,5±0,11 |
7,3–10,2 |
8,9±0,39 |
|
Длина хвоста |
0,36–0,57 |
0,46±0,02 |
0,44–0,62 |
0,55±0,02 |
|
Вульва |
в передней части |
в передней части |
||
|
Длина микрофилярии |
0,22–0,26 |
0,24±0,01 |
0,22–0,28 |
0,25±0,01 |
|
Длина инвазионных личинок |
1,46–1,86 |
1,63±0,05 |
1,12–2,0 |
1,57±0,09 |
Примечание: лимит – границы вариабельности признака, M– средняя арифметическая,m– ошибка средней арифметической. Уровень достоверности Р > 0,05.
Морфологические признаки микрофилярий и инвазионных личинок этих сетарий, как правило, подвержены индивидуальной изменчивости, их видовая специфика выражена значительно слабее.
Анализ оригинальных и литературных данных позволяют сказать, что общее число морфологических признаков сравниваемых видов сетарий не велико. Наиболее надежными, как указано выше, следует признать относительные размеры спикул. Более того, анализ данных по особенностям биологии указанных видов сетарий показывает, что роль промежуточных хозяев S. equinaи S. labiatopapillosaвыполняют одни и те же комары родов – Aedes, Culex, Anopheles, и кровососущие мухи – Haematobia, Stomoxys [5, 6, 8, 10]. Отмеченные факты также создают определенные трудности в дифференциации не только рассматриваемых видов, но и в целом, многочисленных видов рода Setaria.
Имеющиеся литературные данные [8] относительно локализации S. equinaи S. labiatopapillosaв пищеварительном тракте, соответственно, лошадей и крупного рогатого скота, более чем сомнительны, скорей всего связаны с методическими погрешностями. Исследуемые сетарии, как правило, локализуются в брюшной полости, а иногда – грудной. Об этом свидетельствуют наши исследования, проведенные на большом числе животных, у которых мы находили сетарий только в брюшной полости: S. equina–у лошадей и S. labiatopapillosa – крупного рогатого скота, а также, у овец, коз и верблюдов.
В настоящее время интенсивно изучается молекулярная таксономия гельминтов, в том числе и нематод, с целью установления внутривидовой и межвидовой изменчивости определенных участков гена [3, 4, 12, 14]. Молекулярно-генетические подходы исследования позволяют с высокой степенью достоверности дифференцировать спорных и морфологически сходных видов паразитов.
Нами получены и сопоставлены образцы нематод S.equinaи S.labiatopapillosa фрагменты 5,8S+ITS-2+28S длиной 334 пар оснований (рис.1).
Сиквенсы, полученные в исследованиях, депонированы в Генбанке (NCBI) и эти данные зарегистрированы (KP 723854 и KP 723855). При сравнении частичных последовательностей сиквенсов 5,8S+ITS-2+28SS.equinaи S.labiatopapillosa установлены различия в общей сложности по семи парам нуклеотид, что составляет 2,1 %. Показательно, что обнаруженные при сравнении сиквенсов S.equinaи S.labiatopapillosa вариабельными участками оказались – 65, 131, 184, 235, 318, 325 и 324 нуклеотидами. Так, в позиции 65 – у S.equina тимин, а у S.labiatopapillosa – гуанин, в 131, 234, 318 у S.equine – аденин, а у S.labiatopapillosa – гуанин, в 184, 325 у S.equina– тимин, а у S.labiatopapillosa – цитозин.
В результате сравнительных исследований участков 5,8S+ITS-2+28S рибосомальной ДНК двух видов сетарий установлены значительные различия в строении нуклеотидов. В процентном отношении различия в сиквенсах между исследуемыми видами сетарий составили 2,1 %. Можно отметить, что по обнаруженным признакам указанные виды четко различаются.
Аналогичные результаты были получены и при изучении участка СОХ-1 (CO1) митохондриальной ДНКи участка 12S рибосомальной ДНК этих и других видов сетарий [11, 13].Широкое использование методов молекулярной биологии окажется полезным для идентификации нематод, морфологически сходных форм.
Рис.1 Сравнение консенсусных нуклеотидных последовательностей Setariaequina и Setarialabiatopapillosa (направление от 5’ до 3’-конца, точкой обозначены нуклеотидные основания)
1. Аргинский Н. И. Насекомые и клещи, вредящие сельскохозяйственным животным. - Москва: Сельхозиздат, 1962. - С. 74-91.
2. Кабилов Т. К. Гельминты позвоночных животных Узбекистана, развивающиеся с участием насекомых. - Ташкент: Фан, Узб. ССР, 1983. - 128 с.
3. Кузнецов Д. Н. Результаты сравнительного изучения спейсерных участков рибосомальной ДНК Telodorsagia circumcincta и T. trifurcata (Nematoda: Ostertaginae). // Рос. паразитол. журнал. - М., 2009. - № 2. - С. 16-23.
4. Кучбоев А. Э., Абраматов М. Б., Халилов И. М. и др. Сравнительное изучение второго внутреннего спeйсера (ITS2) рибосомальной ДНК видов Haemonchus contortus и H. placei (Nematoda: Trichostrongylidae). // Узбекский биол. журнал. - Ташкент, 2012. - № 1. - С. 38-42.
5. Сапаров К. А., Голованов В. И., Акрамова Ф. Д. и др. Эколого-фаунистический анализ нематод подотряда Filariata - паразитов млекопитающих Узбекистана.// Рос. паразитол. журнал. - Москва, 2012. - № 4. - С. 29-37.
6. Сапаров К. А., Акрамова Ф. Д., Шакарбоев Э. Б. и др. Фауна и биологические особенности личинок нематод, развивающихся с участием кровососущих насекомых. // Докл. АН РУз. - Ташкент, 2013. - № 2. - С. 81-83.
7. Скрябин К. И. Методы полных гельминтологических вскрытий позвоночных, включая человека. - М., Л.: Изд. МГУ, 1928. - 45 с.
8. Сонин М. Д. Основы нематодологии. Филяриаты животных и человека и вызываемые ими заболевания. - М.: Наука, 1977. - Т. 28. - 220 с.
9. Султанов М. А., Азимов Д. А., Гехтин В. И., Муминов П. А. Гельминты домашних млекопитающих Узбекистана. - Ташкент, 1975. - 184 с.
10. Anderson R. K. Nematode parasites of vertebrates: their development and transmission. - New York: CAB International, 2000. - 650 p.
11. Casiraghi M., Bain O., Guerrero R. et al. Mapping the presence of Wolbachia pipentis on the phylogeny of filarial nematodes: evidence for symbiont loss during evolution. // Int. J. Parasitol. 34, 2004. - P.191-203.
12. Dallas J. F., Irvine J., Halvorsen O. DNA evidence that Marshallagia marshalli Ransom, 1907 and M. ocidentalis Ransom, 1907 (Nematoda: Ostertagiinae) from Svalbard reindeer are conspecific. // Systematic Parasitology, 2001. № 50. - Р. 101-103.
13. Jayasinghe D. R., Wijesundera W. S. S. Differentiation of Setaria digitata and Setaria labiatopapillosa using molecular markers. // Vet. J., 2003. - No 165. - P.136-142.
14. Kuchboev A. E., Krucken J., Ruziev B. H., von Samson-Himmelstjerna G. Molecular phylogeny and diagnosis of species of the family Protostrongylidae from caprine hosts in Uzbekistan. // Parasitology Research 2015, 114 (4). - P. 1355-1364.
15. Yatawara J., Wickramasinghe S., Nagataki M. et al. Molecular characterization and phylogenetic analyses of Setaria digitata of Sri Lanka based on COI and 12S rDNA genes. // Vet. Parasitology, 2007. - 148. - P.161-165.
