Секреция муцинов MUC5AC и MUC5B (высокогликолизированных макромолекул, гликопротеинов с доминирующим углеводным компонентом), являющихся основными компонентами бронхиальной слизи, обеспечивает барьерную функцию и клиренс проксимальных и дистальных отделов воздухоносного тракта. Гиперпродукция муцинов бокаловидными клетками слизистой оболочки и экзокриноцитами желёз подслизистой основы дыхательных путей, регулируемая активацией генов муцинов под влиянием медиаторов воспалительного (иммунного) ответа, манифестирует развитие бронхолегочной патологии [9, 15]. У больных бронхиальной астмой (БА) продукция муцинов MUC5AC и MUC5B увеличивается, соответственно, в 40-200 и в 3-10 раз, одновременно повышается синтез муцинов MUC2, MUC6, MUC7, MUC8 [9, 14, 15]. Гиперсекреция муцинов нарастает по мере утяжеления течения БА, сопровождается нарушением циркуляции тканевой жидкости в бронхах, дегидратацией муцинового геля и повышением его вязкости за счёт увеличения уровня хондроитинсульфатов, снижения уровня гиалуроновой кислоты и гепарина в составе муцинов, более прочным связыванием геля с поверхностью эпителия [2, 9]. Комплексы муцины-сульфаты определяют сложную фибриллярную структуру и значительное утолщение слизистого слоя бронхов, обусловливают замедление скорости движения бронхиального секрета, нарушение мукоцилиарного клиренса (МЦК) и формирование мукоцилиарной недостаточности (МЦН) [2, 7, 9, 14].В соответствии с представлением о включении в феномен обструкции дыхательных путей быстрой реакции – бронхоконстрикции и медленных реакций – воспалительной экссудации и гиперсекреции муцинов, в верхних дыхательных путях больных БА с холодовой гиперреактивностью дыхательных путей (ХГДП) в ответ на назальную изокапническую гипервентиляцию холодным воздухом увеличивается содержание гликопротеинов [5]. Установлено, что продолжительная гиперсекреция бронхиальных муцинов оказывает негативное влияние на функцию внешнего дыхания таких больных [5].В исследованиях in vitro было показано, что в результате холодового воздействия на дыхательные пути резко возрастает продукция муцинов бокаловидными клетками покровного эпителия, в меньшей степени – экзокриноцитами желез трахеи и бронхов [8]. При длительном холодовом воздействии в дыхательных путях развивается комплекс специфических изменений мукополисахаридного обмена с преобладанием кислых гликозаминогликанов (ГАГ), индукцией воспаления, катаболических процессов, репаративного коллагенообразования, стромального фиброза и склероза [8]. Изучение роли гиперсекреции мукопротеидов, нейтральных полисахаридов и кислых ГАГ для механизмов развития гиперреактивности, МЦН и ремоделирования бронхов у больных БА следует рассматривать в комплексе с проблемой негативного влияния низких температур атмосферного воздуха Северо-Восточного региона, который способствует мофофункциональной перестройке органов дыхания, в том числе статуса мукоцитов воздухоносного тракта.Целью настоящей работы явилось изучение характера изменений, происходящих в структурной организации клеточных элементов и секреторной активности бронхиального бокаловидного эпителия у больных БА с ХГДП в ответ на холодовую бронхопровокацию. Материалы и методы исследования В исследовании приняли участие 28 больных лёгкой персистирующей формой БА согласно критериям GINA [13]. Дизайн работы предусматривал оценку симптомов БА с использованием валидизированного вопросника Аsthma Control Test (АСТ, Quality Metric Inc., 2002) за последние 4 недели до проведения обследования, исследование базовой функции внешнего дыхания при спирометрии (Easy on-PC, nddMedizintechnik AG, Швейцария) [6], после которого осуществлялся сбор индуцированной мокроты по стандартной методике [10], на следующий день сбор спонтанно продуцируемой мокроты проводился после выполнения 3-минутной пробы изокапнической гипервентиляцией холодным (-20ºС) воздухом (ИГХВ). По результатам реакции дыхательных путей на ИГХВ обследованные больные были распределены в группы: в 1 группу (14 человек) вошли пациенты с ХГДП, во 2 группу (14 человек) – пациенты с отрицательной реакцией на бронхопровокационную пробу (ΔОФВ1=-14,6±2,0 и -2,8±1,3%, р=0,000001, соответственно). Пациенты были сопоставимы по основным антропометрическим параметрам (возраст 40,4±3,2 и 39,8±2,7 лет, р=0,89; рост 170,7±2,7 и 167,9±2,4 см, р=0,46, соответственно), функции внешнего дыхания (ОФВ1=93,2±5,0 и 98,7±5,4%, р=0,47) и уровню контроля над заболеванием (АСТ=16,1±2,1 и 19,1±2,0 баллов, р=0,32). Цитологическое исследование мокроты проводили не позднее 2 часов после её получения стандартным методом при помощи светооптической иммерсионной микроскопии. Подсчитанное количество клеток выражали в процентах. Степень деструкции и интенсивности цитолиза клеток бронхиального эпителия и бокаловидных эпителиальных клеток определяли по методу Л.А.Матвеевой [3]. Выделяли пять классов деструкции клеток в зависимости от изменений структурной целостности клеточных элементов: 0 – нормальная структура; I – частичное (не более 1/2) деструктивное повреждение цитоплазмы, нормальная структура ядра; II – значительная (более 1/2), но неполная деструкция цитоплазмы, частичное повреждение ядра; III – полная деструкция цитоплазмы, значительная деструкция ядра; IV – полная деструкция с распадом цитоплазмы и ядра. Вычисляли суммарный индекс деструкции клеток (ИДК) и индекс интенсивности цитолиза клеток (ИЦ, как отношение наиболее разрушенных клеток к содержанию остальных поврежденных клеток): ИДК=n1+n2+n3+n4)/100; ИЦ=n4/(n0+n1+n2+n3+n4),  где 0, 1, 2, 3, 4 – номера классов деструкции; n0, n1, n2, n3, n4 – количество клеток соответствующего класса.Для изучения содержания гликопротеинов в бокаловидных эпителиальных клетках после фиксации препаратов в формалине использовали метод окраски цитологических мазков альциановым синим, элективно выявляющим муцины (гликопротеины, кислые ГАГ) в цитоплазме бокаловидных клеток [4]. Уровень содержания гликопротеинов (ГАГ) в бокаловидном эпителии оценивали по количеству окрашенных альциановым синим клеток, выраженному в процентах. Статистический анализ полученного материала проводился на основе стандартных методов вариационной статистики. Для определения уровня статистической значимости различий использовали параметрический критерий (t) Стьюдента (парный, непарный), в случаях негауссовых распределений - непараметрический критерий Колмогорова-Смирнова. С целью определения степени связи между двумя случайными величинами проводили корреляционный анализ, рассчитывали коэффициент корреляции (r). Для всех величин принимался во внимание минимальный уровень значимости (р) 0,05. Результаты исследования и их обсуждение В ответ на пробу ИГХВ в цитограммах мокроты больных обеих групп количество клеток десквамированного бронхиального эпителия характеризовалось тенденцией к увеличению. Так, у пациентов 1 группы исходное количество эпителиальных клеток составило 1,5±1,20%, после пробы ИГХВ – 1,6±0,54% (р=0,97), у пациентов 2 группы 1,7±1,16 и 2,4±0,89% (р=0,19), соответственно. При этом, если число бокаловидных клеток в мокроте после холодовой бронхопровокации во 2 группе двукратно прирастало с 0,07±0,04 до 0,14±0,04% (р=0,092), то в 1 группе наблюдалось их снижение с 0,22±0,02 до 0,16±0,02% (р=0,037), что косвенно могло свидетельствовать о формирующейся у них МЦН. Известно, что чем меньше бокаловидных клеток, продуцирующих жидкий секрет, насчитывается в структуре эпителия, тем более вероятно развитие в дыхательных путях нарушений эскалации бронхиального секрета во внешнюю среду [2].В ответ на кратковременную бронхопровокацию холодным воздухом в обеих группах больных прослеживалась тенденция к увеличению цитологических показателей деструкции бокаловидных клеток бронхиального эпителия, представленная данными ИДК бокаловидных клеток (табл. 1, 2). Согласно значениям ИЦ, базовый цитолиз бокаловидных клеток у больных 1 группы был более интенсивным, чем во 2 группе, однако после холодовой стимуляции уровень интенсивности цитолиза не изменялся, между тем как во 2 группе цитолитическая активность бокаловидных клеток достоверно увеличивалась (табл. 1, 2). Кроме того, у этих больных наблюдалась интенсификация деструктивно-цитолитических процессов бронхиального эпителия в ответ на пробу ИГХВ (табл. 2), тогда как в 1 группе показатели ИДК и ИЦ после провокации характеризовались лишь тенденцией к увеличению (табл. 1). Таблица 1Индексы деструкции клеток и интенсивности цитолиза (ИДК, ИЦ, усл. ед.), классы деструкции клеток (в %) в мокроте больных БА с ХГДП (М±m) ПоказательБазовыйПосле пробы ИГХВDрБронхиальный эпителийИДК БЭ0,43±0,030,48±0,020,04±0,040,29ИЦ БЭ0,20±0,020,22±0,010,02±0,020,52n056,5±2,952,9±2,83,6±4,10,40n115,0±2,117,1±1,82,1±2,00,39n25,6±0,606,9±0,681,2±0,70,36n34,0±0,544,4±0,420,4±0,240,14n419,6±2,218,9±1,60,77±2,460,76Бокаловидные клеткиИДК БК0,45±0,020,51±0,020,07±0,020,045ИЦ БК0,20±0,040,20±0,020,004±0,040,27n055,4±3,048,8±2,96,7±3,10,13n115,4±2,217,9±1,82,5±2,50,34n26,1±0,707,5±0,901,4±0,890,14n34,3±0,475,0±0,610,67±0,470,18n420,0±3,320,4±2,10,42±4,40,93 Примечание: здесь и в таблице 2: n0, n1, n2, n3, n4 – количество клеток 0, I, II, III, IV классов деструкции. БЭ – бронхиальный эпителий, БК – бокаловидные клетки; р – достоверность различий показателей в ответ на пробу ИГХВ . Анализ дифференцировки бокаловидных клеток в мокроте по классам деструкции в группе больных с ХГДП в ответ на пробу ИГХВ показал незначительную тенденцию к повышению количества клеточных элементов, в различной мере разрушенных (I–III классы деструкции), при снижении числа клеток, сохранивших структурную целостность цитоплазмы и ядра (0 класс деструкции) (табл. 1, рис. 1–5). У этих же больных, в результате холодового воздействия также прослеживалась тенденция к снижению количества бронхиального эпителия нормальной структуры, увеличение числа повреждённых эпителиальных элементов I, II и III классов деструкции и незначительное снижение числа полностью некротизированных эпителиоцитов IV класса деструкции. Во 2 группе, после кратковременной холодовой бронхопровокации мы наблюдали увеличение числа частично разрушенного бронхиального и бокаловидного эпителия, со статистически значимой активизацией в отношении I и IV классов деструкции (табл. 2). В ответ на пробу ИГХВ отмечалось более значимое снижение количества бронхиальных эпителиоцитов и бокаловидных клеток 0 класса деструкции по сравнению с 1 группой (табл. 2). Можно предположить, что у больных БА с ХГДП холодиндуцированная бронхоспастическая реакция, активирующая деструкцию и цитолиз покровного эпителия с уменьшением содержания бокаловидных клеточных элементов, одновременно инициирует включение компенсаторных механизмов, препятствующих распаду ядра и некрозу бокаловидных клеток, тормозящих процесс тотальной деструкции IV класса и способствующих относительно стабильному уровню содержания клеток 0 класса. Бокаловидные клетки 0 класса деструкции, сохраняющие физиологическую структуру ядра и цитоплазмы, относятся к нормально функционирующим мукоцитам, которые, согласно данным литературы, накапливают в апикальном полюсе цитоплазмы секрет, содержащий нейтральные мукополисахариды и ГАГ [8]. В результате мерокриновой секреции мукопротеины выделяются из бокаловидных клеток и равномерно распределяются в слизистом слое, покрывающем поверхность ресничек цилиарного эпителия бронхов [8]. Таблица 2Индексы деструкции клеток и интенсивности цитолиза (ИДК, ИЦ, усл. ед.), классы деструкции клеток (в %) мокроты больных БА с отсутствием реакции дыхательных путей на холодовой стимул (М±m) ПоказательБазовыйПосле пробы ИГХВDрБронхиальный эпителийИДК БЭ0,45±0,020,53±0,020,08±0,020,001ИЦ БЭ0,16±0,020,18±0,01*0,1±0,20,66n056,4±1,948,6±2,87,9±2,30,004n116,0±1,721,4±1,4*5,4±1,50,003n25,9±0,816,4±0,640,50±1,10,66n34,9±0,165,1±0,070,14±0,140,34n415,7±1,718,9±1,83,2±2,80,26Бокаловидные клеткиИДК БК0,38±0,020,47±0,030,9±0,020,002ИЦ БК0,14±0,020,20±0,020,05±0,030,096n061,8±2,552,9±3,28,9±2,30,002n112,6±1,115,7±1,33,1±1,40,045n26,4±0,845,7±0,710,7±1,050,50n34,5±0,824,3±0,480,21±0,720,77n414,3±1,720,7±1,96,4±2,70,036 Примечание: * – достоверность различий показателя между 1 и 2 группами (р˂0,05). Обнаруженные после воздействия холодового триггера в дыхательных путях больных 1 группы бокаловидные клетки 0 класса деструкции в доле, близкой к исходной, могут быть охарактеризованы как клетки с мобилизованной синтетической и секреторной активностью, стимулированной оксидативным стрессом и адаптивно-приспособительной активацией нейтрофильного звена гранулоцитарного сегмента бронхиального воспаления.Актуализация морфофункционального профиля нейтрофилов в воспалении, сопряженном с развитием реакции бронхов на холодовой стимул, может быть проиллюстрирована ростом уровня нейтрофилов в мокроте больных в ответ на пробу ИГХВ. У больных 1 группы количество нейтрофилов увеличилось с 39,9±2,8 до 54,0±2,3% (р=0,0004), у больных 2 группы – с 40,6±2,8 до 53,1±2,3% (р=0,0004). При этом профиль эозинофилов в цитограммах мокроты пациентов как 1, так и 2 групп достоверно не изменялся, составив в среднем для 1 группы 10,0±2,2 и 10,4±1,6% (р=0,14), для 2 группы – 7,1±1,2 и 8,1±1,1% (р=0,32), соответственно, до и после пробы ИГХВ. На фоне этого происходило уменьшение числа макрофагов с 45,3±3,4 до 31,4±2,6% (р=0,005) в 1 группе, с 44,3±3,3 до 31,7±3,1% (р=0,0003) во 2 группе, на фоне усиления цитоза с 2,4±0,16 до 3,1±0,16% (р=0,0007) и с 2,1±0,12 до 2,5±0,12% (р=0,003), соответственно. При цитохимической реакции на ГАГ и гликопротеины количество бокаловидных клеток, окрашенных альциановым синим, в мокроте больных увеличивалось после пробы ИГХВ: в 1 группе с 59,8±3,3 до 70,8±4,0% (р=0,0002), во 2 группе – с 50,6±3,3 до 61,1±2,7% (р=0,0002). Найденные межгрупповые различия данных показателей, характеризующих интенсивность генерации муцинов в бокаловидном эпителии как исходно, так и после пробы ИГХВ, позволяют прийти к следующему утверждению. Больные БА с ХГДП имеют более высокую базовую концентрацию гликопротеинов в покровном эпителии по отношению к больным, не имевшим реакции дыхательных путей на холодный воздух (р=0,07); при развитии бронхоспастической реакции содержание гликопротеинов у этих больных значимо прирастает, что даёт основание сделать вывод о холодиндуцированной эскалации секреторной муциновой активности бокаловидных клеток бронхиального эпителия.В исследованиях in vitro структуры слизистой оболочки и гистохимической характеристики углеводных соединений воздухоносного тракта при длительном холодовом воздействии установлено, что после разрушения бронхиального эпителия в участки разрушения и в базальную мембрану внедряются мигрирующие из соединительной ткани тучные клетки [8]. Основным цитоплазматическим включением тучных клеток является кислый сульфатированный гликозоаминогликан – гепарин, в соединении с белками гранул образующий протеогликан, подвергающийся экзоцитозу и принадлежащий к необходимым компонентам межклеточного вещества соединительной ткани дыхательной системы [1]. Тучные клетки являются активными продуцентами протеаз, гистамина, допамина, фактора агрегации тромбоцитов и стимуляции секреции гистамина (PAF), медленно реагирующей субстанции анафилаксии (SRS-A) и других цитокинов Th2 и Th1 типов, простагландинов, лейкотриенов, в частности, LTB4, вызывающего агрегацию и дегрануляцию нейтрофилов, активацию лейкоцитов и миграцию нейтрофилов и эозинофилов в очаг воспаления [12, 16].   Рис. 1. Бокаловидные клетки I и II классов деструкции. Мазок мокроты больного БА с ХГДП после пробы ИГХВ. Окраска альциановым синим. Увеличение: 1250.Рис. 2. В центре препарата разрушенные бокаловидные клетки IV класса деструкции, рядом дегранулирующая тучная клетка. По направлению к периферическим участкам бокаловидные клетки II–III классов деструкции. Мазок мокроты больного БА с ХГДП после пробы ИГХВ. Окраска альциановым синим. Увеличение: 1250.   Рис. 3. Бокаловидные клетки I, II, III и IV классов деструкции. Мазок мокроты больного БА с ХГДП после пробы ИГХВ. Окраска альциановым синим. Увеличение: 1250. Рис. 4. Вверху среди бокаловидных клеток III–IV классов деструкции и по периферии препарата единичные клетки с частично поврежденным ядром (II класс деструкции). Мазок мокроты больного БА с ХГДП после пробы ИГХВ. Окраска альциановым синим. Увеличение: 1250.   Рис. 5. Скопление бокаловидных клеток с полным разрушением цитоплазмы, значительным или полным распадом ядра (III–IV классы деструкции). Мазок мокроты больного БА с ХГДП после пробы ИГХВ. Окраска альциановым синим. Увеличение 1250. Рис. 6. Бокаловидные клетки и гранулярные лейкоциты среди большого количества слизи. Слизь с явлениями биокристаллизации. Мазок мокроты больного БА с ХГДП после пробы ИГХВ. Окраска альциановым синим. Увеличение: 1250. Так как в мазках мокроты больных БА с ХГДП в ответ на пробу ИГХВ нередко выявлялись тучные клетки (рис. 2), можно высказать предположение о взаимосвязи между развитием ХГДП и стимулированной оксидативным стрессом миграцией тучных клеток в их просвет. Вероятно, при чрезмерной реакции бронхов на кратковременную холодовую провокацию активность бронхиального тучноклеточного аппарата как короткодистантного регулятора тканевого гомеостаза интенсифицируется, что способствует повышению проницаемости сосудов микроциркуляторного русла, воспалительной экссудации и инфильтрации, функциональной активации лейомиоцитов, индуцирующих бронхоспазм. Установлено, что в процессе повреждающего холодового воздействия и трансформации мерцательного эпителия в многослойный плоский базальная мембрана бронхов гиалинизируется, нейтральные полисахариды и кислые ГАГ накапливаются в поверхностных слоях эпителия и утолщенной базальной мембране, в рыхлой соединительной ткани и стенке кровеносных сосудов [8]. Базальный слой эпителия инфильтрируется эозинофилами и тучными клетками, на поверхности эпителия накапливается большое количество неравномерно распределенного вязкого секрета, имеющего ШИК-позитивную реакцию. Повышенная реакция на ГАГ сопровождает метахромазию, набухание, фрагментацию и гомогенизацию коллагеновых волокон слизистой оболочки, что служит проявлением нарушений взаимоотношений между коллагеном и белково-углеводными комплексами, цементирующими вещество волокон [8]. В составе рыхлой соединительной ткани возрастает число малодифференцированных фибробластов и активно синтезирующих коллагенобластов, активирующихся увеличением ГАГ и ШИК-позитивных веществ и отображающих последовательное развитие гуморальных и клеточных фаз воспаления. Хроническое воспаление, фибриллогенез, фиброз и склероз стромы бронхов, индуцируемые накоплением ГАГ и мукопротеидов [8], лежат в структурной основе ремоделирования дыхательных путей, обусловленного их реакцией на многократное и продолжительное холодовое воздействие. Морфофункциональная перестройка слизистой оболочки бронхов в этом случае характеризуется как соответствующая стадии адаптивного напряжения, переходящего в стадию стабилизации [7,8].В ультраструктурной картине мерцательного эпителия при длительном холодовом воздействии in vitro, сопровождающем пролиферативно-воспалительные и склеротические изменения бронхов, подчеркиваются выраженные деструктивные изменения ресничек и микроворсинок реснитчатых эпителиоцитов, дающих положительную реакцию на мукоид, и обилие слизистого секрета, содержащего большое количество ГАГ, микроорганизмов и наночастиц, на поверхности эпителиального пласта [7]. Утолщенный слизистый слой препятствует движению ресничек и снижает эффективность продвижения секрета в дыхательных путях. Морфологическим признакам мукоцилиарной дисфункции соответствуют полученные нами данные о структуре слизистого секрета в микропрепаратах индуцированной мокроты больных БА с синдромом ХГДП. Так, в мазках мокроты пациентов 1 группы можно было наблюдать «замурованность» клеток эпителия и полиморфноядерных лейкоцитов в обильный кристаллообразующий муциновый гель (рис. 6). По мнению ряда авторов, нарушение механизма цилиарной синхронизации неизбежно влечет за собой снижение МЦК [9, 11], а деструкция эпителия, увеличивая проницаемость слизистой оболочки бронхов, обеспечивает развитие бронхиальной гиперреактивности [8]. О влиянии накопления гликопротеинов в эпителии бронхов на развитие ХГДП у больных БА можно судить по корреляционной зависимости между величиной реакции бронхов в ответ на пробу ИГХВ и обнаруженном в мокроте пациентов 1 группы после пробы количеством клеток бокаловидного эпителия, содержащим гликопротеины (r=-0,47; р=0,041). Из найденной корреляционной связи следует, что, чем выше концентрация гликопротеинов (ГАГ) в бокаловидном эпителии бронхов, тем более выраженной является реакция дыхательных путей на холодовой стимул. Кроме того, уровень контроля над заболеванием (АCТ) был тесно связан с количеством найденных в мокроте БК (r=-0,37; р=0,028).Таким образом, в результате реакции бронхов на холодовой стимул у больных БА с ХГДП усиливались признаки дезорганизации бронхиального эпителия, активировались деструкция и цитолиз бокаловидно-клеточного компонента, повышалась генерация муцинов бокаловидными клетками. У этих больных наблюдалось базовое накопление гликопротеинов в бокаловидном эпителии бронхов, превышающее аналогичные показатели у больных БА с отсутствием гиперреактивности дыхательных путей на пробу ИГХВ. Увеличение реакции дыхательных путей на острую холодовую бронхопровокацию сопровождалось повышением концентрации гликопротеинов в мокроте. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант №17-54-53162 ГФЕН_а).