Развитие бронхоспастической реакции у больных бронхиальной астмой (БА) в ответ на вдыхание холодного атмосферного воздуха ассоциируется с высокой чувствительностью рецепторов дыхательных путей [11], в частности, холодовых рецепторов ТRPM8, функционирующих в эпителиальных клетках бронхов как термочувствительные ионные каналы [24] и индуцирующих экспрессию гена муцина MUC5AC [21]. В свою очередь, секретируемые бокаловидными клетками слизистой оболочки и мукоцитами желёз подслизистой основы бронхов муцины MUC5AC и MUC5B являются основными макромолекулярными компонентами бронхиальной слизи [25], обеспечивающими барьерную функцию и клиренс проксимальных и дистальных отделов воздухоносного тракта и манифестирующими в случае гиперпродукции развитие бронхолегочной патологии [4, 15]. У больных БА гиперпродукция муцинов MUC5B (в 3-10 раз), MUC5AC (в 40-200 раз), MUC2, MUC6, MUC7, MUC8 сопровождается дегидратацией муцинового геля, повышением его вязкости и более прочным связыванием с поверхностью эпителия, что приводит к замедлению скорости движения бронхиального секрета, нарушению мукоцилиарного клиренса (МЦК) и формированию мукоцилиарной недостаточности (МЦН) [15, 22].По мере нарастания тяжести БА и активации воспаления в слизистой оболочке бронхов снижается количество цилиарных и бокаловидных эпителиальных клеток, прогрессирует склероз стромы и микрососудов, нарушается циркуляция тканевой жидкости, увеличивается содержание в просвете бронхов хондроитинсульфатов, снижается уровень гиалуроновой кислоты и гепарина, что повышает вязкость бронхиального секрета [2]. В исследованиях in vitro установлено, что синтезируемые бокаловидными клетками комплексы муцины-сульфаты при длительном холодовом воздействии на бронхи составляют 60-70% вещества гелеобразного слоя слизи. Они определяют сложную фибриллярную структуру и значительное утолщение слизистого слоя, препятствуя движению ресничек цилиарных эпителиоцитов, подвергающихся деструктивным изменениям [13]. В базальном отделе эпителиального пласта, базальной мембране слизистой оболочки бронхов увеличивается реакция на гликозаминогликаны (ГАГ), в соединительной ткани по ходу волокнистых структур и в стенке кровеносных сосудов – реакция на ШИК-позитивные полисахариды [14]. Как известно, мукоцилиарная дисфункция является общей характеристикой всех хронических воспалительных заболеваний дыхательных путей [23]. Ремоделирование и фиброз бронхов, связанные с ростом бронхиальной обструкции и степени тяжести болезни у больных БА, в том числе формирующиеся на фоне длительного холодового воздействия, как показали исследования in vitro, инициируются комплексом нарушений углеводного обмена. При этом гиперпродукция секреторными эпителиальными и соединительнотканными клетками десмо-эпителиального барьера бронхов мукопротеидов, полисахаридов и кислых ГАГ развивается на фоне деструкции, дедифференцированности и плоскоклеточной метаплазии покровного эпителия [2, 14]. В аспекте значения трансформации эпителия для формирования МЦН, персистенции воспаления, индукции ремоделирования и эскалации нарушения проходимости бронхов особую актуальность приобретает изучение морфофункциональной активности секреторного отдела бронхиальной паренхимы у больных БА с гиперреактивностью дыхательных путей на воздействие холодного воздуха. Целью настоящей работы явилось изучение структурной организации и деструктивно-цитолитической активности бокаловидного бронхиального эпителия в зависимости от профиля воспалительного паттерна бронхов и клинических проявлений болезни у больных БА с холодовой гиперреактивностью дыхательных путей (ХГДП). Материалы и методы исследования У 45 больных легкой персистирующей формой БА согласно критериям GINA [16] (средний возраст 39,3±1,6 года) изучали клиническое течение заболевания, уровень контроля над ним по данным валидизированного вопросника Аsthma Control Test, в баллах (АСТ, Quality Metric Inc., 2002); исследовали базовую функцию внешнего дыхания (ОФВ1) по стандартной методике на аппарате Easy on-PC (nddMedizintechnik AG, Швейцария) с оценкой реакции дыхательных путей (∆ОФВ1) в ответ на введение β2 агониста и при проведении стандартной 3-минутной изокапнической гипервентиляции холодным (-20ºС) воздухом (ИГХВ) [5]; осуществляли сбор индуцированной мокроты (ИМ) по стандартной методике, описанной нами ранее [10, 16].Цитологическое исследование индуцированной мокроты (ИМ) проводили не позднее 2 часов после ее получения. Отбирался материал с минимальным уровнем контаминации плоскоклеточным эпителием (менее 20% плоских эпителиоцитов от всех клеток). Подсчитанное количество клеток выражали в процентах от общего числа [10, 16].Степень деструкции и интенсивности цитолиза клеток бронхиального эпителия, бокаловидных эпителиальных клеток, эозинофилов и нейтрофилов определяли по методу Л.А.Матвеевой [3]. Выделяли пять классов деструкции клеток в зависимости от изменений структурной целостности клеточных элементов: 0 – нормальная структура; 1 – частичное (не более 1/2) деструктивное повреждение цитоплазмы, нормальная структура ядра; 2 – значительная (более 1/2), но неполная деструкция цитоплазмы, частичное повреждение ядра; 3 – полная деструкция цитоплазмы, значительная деструкция ядра; 4 – полная деструкция с распадом цитоплазмы и ядра. Вычисляли суммарный индекс деструкции клеток (ИДК) и индекс интенсивности цитолиза клеток (ИЦК, как отношение наиболее разрушенных клеток к содержанию остальных поврежденных клеток): ИДК=n1+n2+n3+n4)/100; ИЦК=n4/(n0+n1+n2+n3+n4),  где 0, 1, 2, 3, 4 – номера классов деструкции; n0, n1, n2, n3, n4 – количество клеток соответствующего класса.Обследованные больные были разделены на 2 группы. В 1 группу были включены пациенты с ХГДП, в группу сравнения (2 группа) − с отсутствием реакции бронхов в ответ на пробу ИГХВ (DОФВ1 -19,9±1,6 и -4,2±1,0, соответственно, р=0,000001). Протокол клинического исследования был одобрен локальным Комитетом по биомедицинской этике ДНЦ ФПД. Больные, после знакомства с протоколом, давали своё письменное согласие на участие в проведении исследований.Статистический анализ полученного материала проводился на основе стандартных методов вариационной статистики. Для определения достоверности различий использовали непарный критерий t (Стьюдента). С целью определения степени связи между двумя случайными величинами проводили корреляционный анализ, рассчитывали коэффициент корреляции (r). Для всех величин принимались во внимание уровни значимости (р) 0,05 и выше. Результаты исследования и их обсуждение Клинически больные 1 группы характеризовались большей выраженностью основных респираторных симптомов в последние 4 недели до момента обследования: числом эпизодов затруднённого дыхания, ночным дыхательным дискомфортом, кашлем, более частым использованием короткодействующего бронхолитика, что проявляло себя в низком количестве набранных баллов при ответе на вопросы ACT, а также более низкими спирометрическими показателями бронхиальной проходимости (ОФВ1/ЖЕЛ) (табл. 1).Таблица 1Клинико-функциональная характеристика больных (М±m) Показатель1 группа (n=26)2 группа (n=19)рВозраст, лет41,3±1,739,4±2,30,50АСТ, баллы15,2±1,319,5±1,40,043ОФВ1, %долж.85,8±3,493,7±4,50,16ОФВ1/ЖЕЛ, %71,2±1,977,2±2,20,047DОФВ1, %БЛ15,1±3,19,9±2,50,21 Примечание: здесь и в таблице 2: р – достоверность различий показателей между группами; БЛ – изменение показателя в ответ на введение бронхолитика. Цитологические показатели деструктивно-цитолитической активности бронхиального эпителия обследованных больных обладали меньшими межгрупповыми различиями по сравнению с показателями структурной организации и дезорганизации бокаловидных эпителиальных клеток, с присущим последним более высоким уровнем различий между группами (табл. 2). Если показатели ИДК и ИЦК бронхиального эпителия в группах достоверно не различались, то для бокаловидных клеток показатель ИЦК у лиц с ХГДП был достоверно выше, чем во 2 группе, что сопровождалось тенденцией и к увеличению ИДК.Таблица 2Индексы деструкции (ИДК) и интенсивности цитолиза клеток (ИЦК), классы деструкции клеток (в %) и клеточные элементы (в %) индуцированной мокроты (М±m) Показатель1 группа2 группарИДК, ИЦК и классы деструкции клеток бронхиального эпителияИДК0,46±0,040,46±0,050,94ИЦК0,24±0,050,22±0,060,90n053,8±4,2054,4±5,00,94n113,5±0,7814,2±0,5,0,53n26,4±0,725,7±1,490,60n33,6±0,873,4±1,230,97n423,6±4,8020,8±6,200,71ИДК, ИЦК и классы деструкции бокаловидных клетокИДК0,45±0,040,37±0,040,20ИЦК0,21±0,020,15±0,020,04n055,4±2,463,0±2,70,047n114,4±1,813,7±2,20,63n28,4±0,896,3±0,820,13n31,5±0,591,8±0,680,72n421,3±2,314,6±2,30,045Клеточные элементы ИМЦитоз2,7±0,312,5±0,180,60Н51,2±3,441,1±3,30,044М26,9±2,837,5±2,50,02Э17,7±3,513,3±3,30,50Л2,9±0,392,9±0,430,77БЭ2,0±1,233,3±1,760,59БК0,17±0,080,18±0,110,96      Примечание: здесь и в таблице 3: n0, n1, n2, n3, n4 – количество клеток 0, I, II, III, IV классов деструкции; Н – нейтрофилы, М – макрофаги, Э – эозинофилы, Л – лимфоциты, БЭ – бронхиальный эпителий, БК – бокаловидные клетки. Дифференцировка клеток по классам деструкции для бронхиального эпителия отличалась более выраженным полиморфизмом, чем для бокаловидных клеток, при отсутствии статистически значимых различий между группами. Обращает на себя внимание, что если у пациентов 1 группы в мокроте прослеживалась лишь незначительная тенденция к увеличению числа клеток бронхиального эпителия, подвергающихся тотальному распаду цитоплазмы и ядра (IV класс деструкции), то количество некротизированных клеток бокаловидного эпителия IV класса деструкции у этих больных статистически значимо превосходило число некротизированных бокаловидных клеток в мокроте больных 2 группы (табл. 2). Для бокаловидного эпителия число клеток 0 класса деструкции, сохранивших структурную целостность, в 1 группе было достоверно более низким по отношению ко 2 группе, что указывало на значительную морфофункциональную перестройку секреторного сегмента эпителия, связанную с активным разрушением полноценно функционирующих клеток, нарушением синтеза муцинов и формированием МЦН. В обеих группах мы наблюдали минимальное количество бокаловидных клеток с деструктурированной, лизированной цитоплазмой и существенно повреждённым ядром, отнесённых к III классу деструкции. Содержание бокаловидных клеток I и II классов деструкции, представляющих начальные этапы повреждения цитоплазмы без повреждения или с частичным повреждением ядра, характеризовалось тенденцией к увеличению в 1 группе по сравнению со 2 группой.Анализ показателей деструктивно-цитолитических изменений бокаловидных клеток больных 1 группы, свидетельствующий о повышенной морфофункциональной уязвимости секреторного компонента эпителия, позволил сделать предположение о наличии связи между чрезмерной реакцией дыхательных путей больных БА на острую пробу ИГХВ и формированием МЦН. Подтверждением может служить зависимость степени тяжести МЦН от выраженности структурных нарушений слизистой оболочки бронхов: снижения частоты биения ресничек и гибели цилиарного эпителия, хронического воспаления, стромального склероза и повышения вязкости бронхиального секрета [2, 12]. К последнему непосредственно причастны активация деструкции и цитолиза, структурная дезорганизация бокаловидных клеток, которые были обнаружены у больных БА с ХГДП.Доказательством сопряженности между разрушением эпителия, формированием МЦН и холодовой гиперреактивностью дыхательных путей можно рассматривать данные о содержании эпителиальных клеток в составе ИМ. Так, у пациентов 1 группы общее количество клеток бронхиального эпителия в ИМ было более низким, чем у больных 2 группы (табл. 2). Как известно, чем меньше клеток, продуцирующих жидкий секрет, насчитывается в структуре эпителия, тем больше вероятность развития в дыхательных путях ситуации ухудшения эскалации бронхиального секрета во внешнюю среду [2].В работах in vitro, посвящённых исследованию секреции муцинов в воздухоносном тракте под действием холодного воздуха, выявлено, что даже непродолжительное влияние холодового триггера стимулирует резкое повышение секреторной активности и выраженную гиперплазию бокаловидных клеток [14]. В норме в апикальном полюсе бокаловидных клеток слизистой оболочки бронхов накапливается секрет, содержащий нейтральные мукополисахариды и ГАГ, выделяющиеся в результате мерокриновой секреции и равномерно распределяющиеся в слизистом слое на поверхности ресничек цилиарного эпителия [14]. При длительном холодовом воздействии бронхиальный эпителий трансформируется в многослойный плоский, базальная мембрана гиалинизируется, нейтральные полисахариды и кислые ГАГ накапливаются в поверхностных слоях эпителия и утолщенной базальной мембране. В базальном слое эпителия появляются мигрирующие эозинофилы и тучные клетки, на поверхности эпителия накапливается большое количество неравномерно распределенного вязкого секрета, имеющего ШИК-позитивную реакцию. Активный фибриллогенез и склероз в строме сопровождаются накоплением ГАГ и мукопротеидов [14].  Активация финальных фаз деструкции и уменьшение общего количества бронхиального эпителия у больных БА с ХГДП, скорее всего, свидетельствуют о более активном, чем у больных с отсутствием реакции на ИГХВ повреждении не только бокаловидных, но и цилиарных клеток, что значительно снижает эффективность продвижения муцинового геля в дыхательных путях. Снижение МЦК обусловлено нарушением описанного в литературе механизма цилиарной синхронизации [15, 17]. При холодовом воздействии утолщенный слизистый слой препятствует движению ресничек: из-за отсутствия «шипообразных» образований на апикальном полюсе реснички не упираются в слой слизи и не перемещают ее в проксимальном направлении [13]. В результате действия на бронхи холодного воздуха in vitro наблюдалось отсутствие в некоторых участках бронхиального эпителия перицилиарной жидкости, ввиду чего реснички не могли осуществлять движения и склеивались [13]. Часть ресничек теряла мембраны, вследствие чего обнаруживались лишь сократительные микротрубочки, вокруг отечных ресничек и в цитоплазме реснитчатых клеток отмечалось накопление кислых мукоидов [13]. Появление цилиарных клеток с «веерообразным» расположением ресничек сопровождалось выпячиванием мембраны апикального полюса и боковых стенок ресничек с образованием микровезикул и уплощенных мембранных пакетов, уплотнением сердцевины и деформацией плазмолеммы склеенных ресничек [13].В неразрывной связи со снижением МЦК и формированием МЦН, опосредованным повреждением эпителия, изменением концентрации соли и воды в бронхиальном секрете, гиперпродукцией муцинов рассматривается нарушение проходимости дыхательных путей, прогрессирующее у больных БА на фоне повышенной бронхососудистой проницаемости, обусловленной воспалительной инфильтрацией паренхимы и стромы [2, 15]. Степень тяжести МЦН тесно сопряжена с тяжестью течения астмы и активностью воспаления в дыхательных путях [12]. Следовательно, профиль воспалительного паттерна бронхов больных БА с ХГДП играет важную роль как для развития МЦН, так и для нарушения бронхиальной проходимости.  Как следует из таблицы 2, в эозинофильном паттерне бронхиального воспаления больных БА 1 группы количество нейтрофилов было достоверно выше, чем у пациентов 2 группы, что сопровождалось статистически достоверным уменьшением числа макрофагов и тенденцией к увеличению числа эозинофилов на фоне усиленного цитоза. Одновременно в 1 группе наблюдалась тенденция к более высоким по сравнению со 2 группой значениям ИДК и ИЦК воспалительных гранулоцитов: ИДК нейтрофилов (0,65±0,05 и 0,50±0,17, соответственно, р=0,44), ИДК эозинофилов (0,32±0,10 и 0,28±0,05, соответственно, р=0,78), ИЦК нейтрофилов (0,50±0,07 и 0,40±0,22, соответственно, р=0,70), ИЦК эозинофилов (0,23±0,05 и 0,16±0,04, соответственно, р=0,34).В проведенных нами ранее исследованиях, касающихся деструкции эпителия бронхов у больных тяжелой БА с ХГДП, эскалация эпителиальной дисфункции, потенцирующей хроническое воспаление, супрессию антиоксидантной и иммунной защиты, ремоделирование бронхов [19], рассматривалась в качестве морфологического маркера инертности достижения уровня контроля над болезнью [9]. Характер массивного повреждения эпителия, с преобладанием III и IV классов деструкции, как один из параметров ремоделирования слизистой оболочки бронхов, в этом случае ассоциировался со смешанным паттерном бронхиального воспаления [8], активация нейтрофильного пула которого оказывала негативное влияние на клинические параметры тяжёлой неконтролируемой БА [7, 8].Стимуляция активированными нейтрофилами повреждения, апоптоза и некроза эпителия обусловлена экзоцитозом при дегрануляции, деструкции и цитолизе гранулоцитов лизосомальных ферментов, таких, как миелопероксидаза, которые обеспечивают генерацию активных форм кислорода и галогенов [6–8], свободно-радикальным повреждением крист митохондрий, разрушением эндоплазматического ретикулума с последующей гибелью эпителия [20]. Считается, что в этом случае сигналы апоптоза передаются в эпителий не по прямому пути, от лигирования рецептора смерти до активации каспазного каскада и гибели клеток, а по пути, опосредованному деэнергизацией эпителиоцитов [20]. Дисфункция поврежденного эпителия, активно развивающаяся при астме, связывается с низким уровнем экспрессии факторов антиоксидантной защиты, в частности, супероксиддисмутазы, способствующим увеличению восприимчивости эпителиальных клеток к агрессивному действию оксидантов, в том числе и генерируемых гранулоцитами [1]. Взаимосвязь между цитологическими признаками эпителиальной дисфункции, активацией нейтрофильного звена эозинофильного паттерна воспаления и нарушением проходимости дыхательных путей прослеживалась в корреляционных связях, найденных у больных БА с ХГДП. Так, для больных 1 группы была установлена зависимость между показателями деструктивно-цитолитической активности бронхиального эпителия, цитолиза бокаловидных клеток и выраженностью обструкции бронхов в ответ на пробу ИГХВ (табл. 3). Корреляционные связи указывали на то, что, чем больше показатели ИДК и ИЦК бронхиального эпителия, тем более выражена реакция бронхов на пробу ИГХВ, а также чем больше содержалось в ИМ клеток бронхиального эпителия IV класса деструкции и чем меньше число клеток бронхиального эпителия 0 класса деструкции, тем больше реагировали больные на холодовую бронхопровокацию. Кроме того, уровень реакции бронхов на пробу ИГХВ зависел от цитолитической активности бокаловидных клеток: чем выше был показатель ИЦК бокаловидных клеток, тем степень выраженности реакции бронхов на ИГХВ была выше, а найденная корреляционная зависимость между величиной DОФВ1ИГХВ и количеством нейтрофилов в ИМ, свидетельствовала о связи активации воспалительного сегмента нейтрофилов, как одной из характеристик паттерна воспаления бронхов больных БА с ХГДП, с холодиндуцированным бронхоспазмом и нарушением проходимости бронхов.Таблица 3Корреляционные связи между показателями деструктивно-цитолитической активности бронхиального эпителия, цитолиза бокаловидных клеток и DОФВ1 ИГХВ у больных бронхиальной астмой с холодовой гиперреактивностью дыхательных путей ПоказателиИДК БЭИЦК БЭn0 БЭn4 БЭИЦК БКНDОФВ1 ИГХВr=-0,82, р=0,007r=-0,81, р=0,008r=0,82, р=0,007r=-0,81, р=0,008r=-0,65, р=0,041r=-0,89 р=0,004 Таким образом, у больных БА с ХГДП выявлены более значимые нарушения в структурной организации и деструкции бокаловидного эпителия бронхов, с активацией гранулоцитарного, преимущественно нейтрофильного, сегмента воспалительного паттерна. Обнаружена зависимость выраженности холодиндуцированного бронхоспазма от интенсивности деструкции и цитолиза бокаловидных клеток, активации нейтрофильного пула воспалительного паттерна и тотального разрушения эпителиоцитов финального IV класса деструкции. Сопряженность дезорганизации секреторного сегмента покровного эпителия на фоне особенностей паттерна воспаления у лиц с ХГДП может быть рассмотрена в качестве фактора риска эскалации МЦН, развития ремоделирования и нарушения проходимости дыхательных путей, ассоциированных с ухудшением клинического течения болезни и снижением уровня контроля над астмой.